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骨折修复重建过程中，再生神经和血管系统对骨痂发挥了严密的、实时的调控作用，相互协调，最终完成骨痂的结构和功能重建。周围神经所分泌的神经肽类物质，降钙素基因相关肽(calcitonin gene related protein，CGRP)，在骨折修复过程中发挥了促进骨痂生成的生物学作用。体外环境下CGRP能够促进成骨细胞增殖，并证明成骨细胞表面有CGRP受体的存在，大量下游细胞信号通路得到证实。但细胞实验研究中，多数实验仅围绕CGRP对成骨细胞(Osteoblasts, OB)或破骨细胞(Osteoclasts, OC)等单一成骨相关细胞展开，而对多细胞间的交互调控作用(Cross-talk)研究较少，因此未能全面完整地说明CGRP在体内多细胞环境下的促成骨机制。成骨细胞和血管内皮细胞(Vascular endothelial cells, VECs)之间存在一种相互影响、相互调控的OB-VECs间cross-talk机制。在骨痂中VECs不仅仅构建了微血管簇为骨痂提供了营养支持，还作为一种具有成骨诱导功能细胞，参与了MSCs的募集和诱导分化。研究发现细胞间cross-talk主要发生在两个层面，一是经由细胞膜之间的蛋白完成细胞与细胞间的直接作用，二是通过自分泌和旁分泌的方式完成细胞间的间接作用。而在骨折愈合过程中，骨痂中的CGRP阳性纤维沿着血管生长，并且有大量的体外实验证实，CGRP在血管再生和形成中也发挥着重要的生物学作用，说明CGRP参与了对OB-VECs之间Cross-talk的调控。基于骨痂中的CGRP对成骨的调控机制可能与VECs细胞相关这一推测，本实验依据课题组的前期预实验结果，建立CGRP干预的OB-VECs共培养体系体，通过对VECs细胞旁分泌成骨因子的检测，和OB细胞对应因子受体表达及细胞分化指标的检测，探讨CGRP对OB-VECs间cross-talk的调控机制。从而在体内及体外多细胞环境下，发现并证实神经通过对VECs旁分泌的调控作用发挥了促成骨效应，进一步阐述骨痂中神经对血管和成骨交互调控的作用机制。方法：1.细胞培养：美国ATCC公司人脐静脉血管内皮细胞HUVECs和人骨肉瘤细胞MG-63细胞株，加入含10%FCS的高糖DMEM培养基，以5×106/瓶密度接种于100ml培养瓶中，置于5%CO2孵箱中37°C孵育72或96h传代，培养传代，6-8代细胞用于共培养实验。2、共培养体系建立：2.1直接共培养：MG-63和HUVECs细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％FCS的DMEM培养液配制成单个细胞悬液，按照不同混合比例的细胞悬液以1×105个/孔密度接种到12孔板，培养后24h后将细胞至于倒置显微镜下进行观察。2.2间接共培养：将MG-63细胞以5×105浓度接种于12孔板，安装0.4μm孔径的12孔板Transtwell小室，将HUVECs细胞以5×105浓度接种于Transtwell小室内。3.间接共培养环境下MG-63细胞的分化：3.1MG-63细胞CollagenⅠ mRNA检测：间接培养24h，48h，72h和96h后，提取MG-63细胞mRNA用于实验检测。Real time PCR检测共培养环境对MG-63细胞CollagenⅠmRNA表达改变影响；3.2培养液中OC检测：间接培养24h，48h，72h和96h后，提取培养液于实验检测，ELISA检测共培养环境对MG-63细胞OC表达改变影响。4. CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞分化的生物学作用：4.1CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞CollagenⅠ mRNA表达的作用：以量效组100nM，10nM，1nM和0.1nM，和时效组0h，24h，48h，72h和96h分组，CGRP干预MG-63-HUVECs共培养体系，获取MG-63细胞mRNA，Real timePCR检测各组细胞CollagenⅠmRNA表达差异。4.2CGRP对间接共培养环境下MG-63细胞OC表达的作用：以量效组100nM，10nM，1nM和0.1nM，和时效组0h，24h，48h，72h和96h分组，CGRP干预MG-63-HUVECs共培养体系，获取MG-63细胞培养液，ELISA检测各组细胞OC表达差异。5.共培养体系中CGRP所诱导的VEGF调控机制：5.1共培养体系中CGRP所诱导的VEGF-A分泌变化：10nM的CGRP作用于MG-63、HUVECs和MG-63-HUVECs间接共培养体系，作用0h，12h，24h，36h，和48h后收集细胞培养液或细胞，进行ELISA和Real Time-PCR测定。5.2共培养体系中CGRP所诱导的MG-63细胞VEGF受体的表达变化：将MG-63与HUVECs细胞Transtwell小室内间接共培养，未加Transtwell小室的MG-63培养为空白对照组(CON)，单独培养加入10nM CGRP的为CGRP作用组(CGRP)；加入Transwell及HUVECs的为共培养组(CO)，同时加入CGRP干预的为实验组(EXP)。培养48h后对MG-63细胞的VEGFR1/2进行免疫荧光检测。结果：1. MG-63-HUVECs细胞共培养：1.1直接共培养： MG-63和HUVECs细胞按照1:4，1:2，1:1，2:1和4:1比例进行共培养，24h发现MG-63：HUVECs按照比例为1:1的直接共培养体系中两种细胞生长最为良好，细胞间杂生长，其中HUVECs细胞呈结节样生长，MG-63细胞生长于内皮细胞结节周围。DiI荧光标记后，MG-63-HUVECs共培养体系24h，HUVECs细胞呈结节样生长，MG-63细胞生长于内皮细胞结节周围，48h，HUVECs细胞结节中央形成细胞坏死，72h，HUVECs细胞与MG-63细胞分层，MG-63细胞向内皮细胞结节内浸润生长，96h，HUVECs细胞出现类管型样结构，MG-63细胞完全布满培养瓶底。1.2间接共培养对MG-63细胞分化的作用：MG-63细胞在与HUVECs细胞间接共培养环境下，其CollagenⅠ mRNA表达明显增加，24h共培养组MG-63细胞所表达的CollagenⅠ mRNA为对照组的1.32，(P<0.05)；48h达到最大值，为对照组的1.57，(P<0.01)。培养液中OC表达随时间增加，且共培养组明显高于对照组，24h，共培养组培养清液中OC含量为对照组的1.54，(P<0.01)；48h为对照组的1.48，(P<0.01)；72h为对照组1.35，(P<0.05)。2. CGRP对间接共培养体系中MG-63细胞的生物学作用：不同浓度的CGRP作用MG-63-HUVECs细胞共培养体系48h后，MG-63细胞的CollagenⅠ mRNA和OC表达均有所增加，以10nM浓度组的MG-63细胞CollagenⅠmRNA和OC表达增高最为明显，分别为对照组1.94(P<0.01)和2.02(P<0.01)。10nM浓度CGRP作用MG-63-HUVECs细胞共培养体系，MG-63细胞CollagenⅠmRNA表达呈现增加趋势，CollagenⅠ mRNA表达于48h达到峰值，为对照组的1.98，(P<0.01)；培养液中的OC含量自24h后呈现增加趋势(P<0.01)，培养液中的OC含量于96h达到峰值，为对照组的2.91。3.共培养体系中CGRP所诱导的VEGF-A调控机制：3.1共培养体系中CGRP所诱导的VEGF-A分泌变化：在10nM CGRP的作用下，HUVECs单独作用组中培养液中VEGF-A含量相对对照组显著上升，在48h达到峰值，为对照组的2.31，VEGF-AmRNA相对对照组显著上升，在24h达到峰值，为对照组的2.71； MG-63单独作用组中培养液中的VEGF-A的含量在36h后随着时间延长出现下降，在48h达到最低值，为对照组的0.66；CGRP干预共培养组中，HUVECs细胞VEGF-A mRNA表达在24h后出现显著增高，24h达到峰值，为对照组的2.42。3.2共培养体系中CGRP所诱导的MG-63细胞VEGF受体表达变化：CGRP升高了共培养体系中MG-63细胞中VEGFR1的表达，10nM CGRP作用48h后，通过交叉对比，CO组VEGFR1表达显著高于CON组，0.186:0.124(p<0.01)；EXP组VEGFR1表达显著高于CON组，0.201:0.124(p<0.01)，并显著高于CGRP组，0.201:0.118(p<0.01)。CGRP和共培养环境分别升高了MG-63细胞中VEGFR2的表达，10nM CPGR作用48h后，通过交叉对比，CGRP组和CO组均显VEGFR2表达著高于CON组，分别为0.177:0.081(p<0.01)和0.154:0.081(p<0.01)；EXP组VEGFR2表达显著高于CON组，0.194:0.081(p<0.01)，并显著高于CO组，0.194:0.154(p<0.05)。结论1. MG-63细胞与HUVECs细胞能够在高糖DMEM培养基中直接共培养，其中以1:1比例为优势比例；血管内皮细胞呈结节样生长，随时间延长有出现管型样结构的趋势，MG-63细胞在其周围生长。2. MG-63-HUVECs间接共培养环境下，Collegen I mRNA表达和分泌型OC增加，促进MG-63细胞的分化成熟。3. CGRP对共培养体系中MG-63细胞CollagenⅠ mRNA和OC表达具有显著地促进作用，以10nM为最佳浓度，CGRP和共培养两种方式均能促进MG-63细胞CollagenⅠ mRNA和OC表达，促进MG-63细胞分化成熟。4. CGRP能够促进MG-63-HUVECs共培养体系中HUVECs细胞表达VEGF-AmRNA，上调MG-63-HUVECs共培养体系中MG-63细胞VEGFR1/2受体表达，以VEGFR2更为显著。但CGRP对MG-63-HUVECs共培养体系培养液中VEGF-A含量无显著影响。