论文部分内容阅读
作为一个重要的转录调控因子,胰腺癌中甲基化 CpG 结合域蛋白 1(methyl-CpG binding domain protein 1 ,MBD1)介导的甲基化转录抑制作用可能是造成众多抑癌基因转录表达下降,以至失活的重要原因。探讨 MBD1 在胰腺癌中的表达、调控及其作用有重要的研究价值。 实验研究通过 RT-PCR 检测 MBD1mRNA 在两株胰腺癌细胞株AsPC-1 和 BxPC-3 中的表达,发现均有较高水平的基础表达。BxPC-3为原发癌细胞株,而 AsPC-1 具有很高的淋巴结转移侵袭活性,并同时具有原发癌的生物学特性,因此选择 AsPC-1 细胞株作为研究平台,探讨 MBD1 的表达、意义和调控。我们利用 RNA 干扰技术,设计合成了针对 MBD1 基因的 siRNAs,并在其上下游分别引入 BgLⅡ和HindⅢ限制性酶切位点,通过双酶切连接反应将 MBD1siRNAs 插入质粒载体 Rotro Super 多克隆位点中的 BgLⅡ和 HindⅢ之间,从而成功构建 MBD1siRNAs 真核表达质粒 Rotro Super-MBD1siRNAs,应用RT-PCR 行酶切鉴定,结果显示 MBD1siRNAs 能成功载入质粒。采用脂 质 体 介 导 的 方 法 将 MBD1siRNAs 表 达 质 粒 转 染 胰 腺 癌 细 胞 系AsPC-1,通过 G-418 的筛选获得稳定表达 MBD1siRNAs 的阳性克隆。 应用RT-PCR和Western-blot方法检测AsPC-1细胞中MBD1在基因水平和蛋白水平的表达变化,采用克隆形成实验和MTT法检测肿瘤细胞增殖能力,利用多点微列阵技术观察甲基化相关基因表达的变化。研究结果显示MBD1siRNAs表达质粒能显著抑制胰腺癌细胞AsPC-1中MBD1mRNA 的表达,且 MBD1在蛋白水平亦受到明显抑制;克隆形成实验和MTT测定生长曲线显示细胞生长受到显著抑制,表明MBD1siRNAs能抑制胰腺癌的细胞增殖能力,降低肿瘤细胞的独立生存能力;利用多点微列阵杂交发现在MBD1 mRNA表达下降的同时,其它甲基化相关抑癌基因CDH1、 RB和 E2F5表达上调恢复。 临床研究应用免疫组织化学法和RT-PCR技术分别从蛋白水平和基因水平检测证实MBD1在胰腺癌临床标本中的表达,并观察区域性动脉灌注化疗对MBD1表达的影响,研究结果表明MBD1蛋白在胰腺癌中的表达(阳性率 76.32%)明显高于正常胰腺、癌旁、慢性胰腺炎和胰腺良性肿瘤组织;RT-PCR同样显示MBD1mRNA在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织和癌旁对照组织(P<0.01)。MBD1的表达水平的高低与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和TNM分期之间无显著性差异;而有淋巴结转移的胰 4<WP=5>博士论文 第 5 页 共 100 页腺癌MBD1表达(阳性率92.31%)明显高于无淋巴结转移者(41.67%),其中7例强阳性表达的胰腺癌病理证实均有16组(腹主动脉旁)淋巴结的转移,说明MBD1与胰腺肿瘤转移和侵袭活性密切相关,检测MBD1对预测胰腺癌患者的预后有指导作用。区域动脉灌注介入化疗能明显抑制MBD1基因的表达(P<0.01)。 总之,研究表明MBD1在胰腺癌中的表达明显增高,并与胰腺癌转移侵袭活性相关,是致癌密切相关基因。MBD1siRNAs能抑制胰腺癌AsPC-1细胞株MBD1的表达及其增殖能力,并可上调其它甲基化相关抑癌基因表达,MBD1可能成为一个新的基因治疗靶点。区域性动脉灌注化疗明显抑制MBD1基因的表达,是一有效的临床治疗措施。