重组鸡γ-干扰素,鸡白细胞介素-18,-2活性及生物学作用的研究

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:tzjgy
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近年来,随着细胞因子基因的克隆及基因工程技术的不断发展,细胞因子作为治疗剂在畜禽养殖业中的广泛应用变得更加可行。在本研究中,我们对重组鸡干扰素-γ(ChIFN-γ)、鸡白细胞介素-18(ChIL-18)和鸡白细胞介素-2(ChIL-2)进行了检测。首先,我们检测了原核表达系统(E.coli)表达的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2的活性,具体方法是:将ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上,构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ、pMelBacB- ChIL-18、pMelBacB-ChIL-2,经限制性内切酶消化、特异引物PCR鉴定和确证性序列测定,证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ、pMelBacB- ChIL-18、pMelBacB- ChIL-2质粒分别与杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染sf9昆虫细胞,经三轮蓝斑筛选,获得了重组杆状病毒。提取病毒DNA经ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2特异引物及重组杆状病毒特异引物PCR鉴定,证明获得了纯化的重组杆状病毒,分别命名为rBaculovirus-ChIFN-γ、rBaculovirus-ChIL-18和 rBaculovirus- ChIL-2。用这些重组病毒接种sf9昆虫细胞,收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE。结果表明ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2基因在昆虫细胞中获得了表达,表达的重组蛋白分子量分别为19KDa、23KDa和16KDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ和 ChIL-2及豚鼠抗ChIL-18多克隆抗体进行Western blot分析,一方面,表明本研究真核系统表达了有活性的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2蛋白,另一方面,表明前期原核系统表达的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2蛋白是有活性的蛋白。为了研究ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2在体内的生物学作用,我们还用E.coli系统表达的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2免疫鸡,在增重试验中,与阴性对照相比,重组ChIFN-γ、ChIL-18能促进生长,增长率最高可达6.1%,并且在传染性支气管炎病毒感染后,重组ChIFN-γ、ChIL-18能减少鸡的体重下降率并迅速恢复体重;在传染性支气管炎病毒感染后,重组ChIFN-γ、ChIL-18能使鸡血清中抗体滴度提高,抗体滴度最高可达1094.9,能够快速清除气管中病毒,还能减轻传染性支气管炎病毒对组织的病理损伤。在本试验中,重组ChIL-2的生物学活性表现得不明显。
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