研究背景和意义胆管癌(Cholangiocarcinoma)最早在1840年由Durand-Fardel教授报道,该肿瘤是一种胆管上皮源性的、高度恶性的肿瘤。在2010年第七版美国癌症联合委员会(the American Joint Committee on Cancer,AJCC)的分类中,根据发生部位不同胆管癌可以分为肝内胆管癌(ICC)和肝外胆管癌(ECC)。ICC源于肝内胆管以及其细小分支胆管树的衬覆上皮;而对于ECC,以胆囊管与肝总管汇合处分界,可进一步分为肝门部胆管癌(又称Klatskin瘤)和远端胆管癌。尽管在世界范围内,胆管癌的发病率仅占所有消化系统恶性肿瘤的3%左右,但作为肝胆系统第二常见的原发性恶性肿瘤,其发病率与死亡率,尤其是ICC,近年来持续增高。目前为止,根治性手术切除是胆管癌唯一有效的根治方法。然而,由于该病起病隐匿、无特征性的早期临床表现,且该肿瘤极易发生淋巴结和远端转移,患者往往在确诊时就已经处于肿瘤晚期,失去了根治性切除的机会。此外,胆管癌对辅助放疗及化疗的敏感性低,放化疗并不能有效降低肿瘤复发的风险。上述这些因素导致绝大多数胆管癌患者的预后不良,5年生存率只有5%左右。因此,探寻在胆管癌发生发展过程中,尤其是其侵袭及转移过程中发挥重要作用的分子,明确其侵袭及转移的机制,对于治疗胆管癌和降低死亡率具有十分重要的意义。整合素属于细胞表面黏附分子家族成员,是一类由α亚单位及β亚单位以非共价键结合的方式组成的跨膜糖蛋白受体。整合素αvβ6是迄今为止发现的唯一一种含有β6亚基的整合素,其表达特征为在胚胎发育时期、组织修复时以及在恶性上皮性肿瘤组织中高表达,而在正常上皮组织、上皮良性肿瘤组织以及其它类型恶性肿瘤组织中不表达。现阶段研究已经证实整合素αvβ6在胃癌、结直肠癌(CRC)、胰腺导管腺癌(βDAC)等多种消化道恶性肿瘤中表达显著提高,且αvβ6的表达水平与上述多种肿瘤的侵袭转移能力密切相关。此外,整合素αvβ6可通过活化多种经典的促癌信号通路而促进肿瘤的发生发展。近年来我们团队研究发现αvβ6并不是固定表达于细胞膜表面,而是通过其自身的内吞胞吐循环过程在细胞质与细胞膜之间进行快速地穿梭,该内吞胞吐循环过程对肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用及肿瘤细胞的迁移运动起到了关键促进作用。我们前期研究还发现αvβ6的β6亚基可直接与细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)连接,该直接连接可活化ERK2下游相关信号通路并进一步通过介导基质金属蛋白酶(MMPs)的表达而促进肿瘤细胞的侵袭。此外,整合素β6还可以通过与SDF-1及IL-8等趋化因子协同作用,共同促进肿瘤细胞的器官靶向转移。在肿瘤组织中特异性表达的特性及其在促进肿瘤恶行进展过程中发挥的重要作用使得整合素β6成为一个肿瘤诊断与治疗的潜在靶点。但是,作为在多种消化道恶性肿瘤中发挥关键作用的重要分子,整合素β6在胆管癌中的表达情况及作用机制仍然不得而知。Rac蛋白属于Rho家族小GTP酶的重要成员之一,该家族成员包括Rac1,Rac2,Rac3和Rac1b。目前为止对于该家族成员的相关研究多集中于Rac1方面。Rac1可作为细胞表面受体下游的关键分子,通过调控多种信号通路而维持细胞的各项正常生理功能。研究发现Rac1在包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌等多种消化道肿瘤组织中表达升高或活性增强,表达上调及活化后的Rac1参与了肿瘤细胞恶性生物学行为的多个方面,如肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移等过程。其中Rac1对肿瘤细胞侵袭转移的关键促进作用使其成为相关领域的研究热点。该作用涉及侵袭转移过程中的多个重要环节,如细胞伪足的形成、细胞与细胞之间的结合、细胞与ECM之间的结合、ECM中胶原成分的水解等。现阶段研究证实了 Rac1在多种胆管癌细胞系中均为高表达,且Rac1对于胆管癌细胞肿瘤微环境的形成、化疗耐药等过程起到至关重要的作用,但有关Rac1促进胆管癌侵袭转移的作用及相应机制目前为止仍知之甚少。为了明确整合素β6在胆管癌中的表达情况及作用机制,为以β6为靶点设计合成抗肿瘤药物提供研究基础与理论支持,本文从以下四个方面进行了研究论证。(1)收集了山东大学齐鲁医院共95例胆管癌患者的病理组织标本及相应临床资料,通过免疫组化的方式检测了整合素β6在胆管癌组织及相应癌旁组织中的表达情况,分析了 β6表达情况与患者临床病理特征的关系,并进一步利用ROC分析明确了 β6可作为胆管癌诊断的一个免疫组化指标,且β6表达情况可有效预测淋巴结转移。(2)随后通过一系列体外实验证实β6能够显著促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)进一步实验我们从多个角度研究发现β6是通过活化Rac1,进而增加F-actin的聚合及MMP-9的分泌而促进胆管癌细胞的迁移侵袭。(4)最后,我们利用裸鼠皮下成瘤动物模型进一步验证了 β6促进肿瘤发展的结论。通过本项目研究我们发现了整合素β6在肿瘤发展过程中作用的一个关键靶点——Rac1,鉴于Rac1在肿瘤发生发展过程中起到的关键作用,提示针对性地干预β6将有望减少胆管癌的侵袭转移,对于胆管癌患者的综合治疗具有十分重要的临床意义和应用前景。第一部分整合素β6在胆管癌组织中的表达情况及临床病理特征的研究目的明确整合素β6在胆管癌组织及相应癌旁组织中的表达情况,分析β6表达与患者各项临床病理特征的联系,探究整合素β6表达状况的临床病理学意义。方法1.收集山东大学齐鲁医院于2006-2013年期间手术切除的胆管癌肿瘤组织及相应癌旁组织病理标本,并采集了相关临床资料,采集的资料包括性别与年龄等一般资料,血清CA19-9水平,血清CEA水平,术后病理信息(包括浸润深度、淋巴结转移情况、肿瘤分化情况等)及远处转移情况等。2.在患者家属知情同意的基础上,采用免疫组织化学(IHC)的方法从蛋白水平检测胆管癌肿瘤组织及相应癌旁组织中β6的表达情况,并邀请两名病理学家进行免疫组化评分,结合相关临床病理学参数,利用卡方检验将量化的免疫组化评分结果进行统计分析。3.根据统计学结果进一步利用ROC曲线分析β6作为胆管癌组织免疫组化指标及预测淋巴结转移的敏感性与特异性。结果1.研究共收集95例胆管癌组织标本及其相应的癌旁组织标本,免疫组化结果显示整合素β6在胆管癌组织中呈中-高程度表达,其表达位置主要位于细胞膜,胞浆中也可见少量表达,而在相应的癌旁组织中整合素β6几乎不表达。2.β6的表达情况与淋巴结转移(P=0.0003)、远处转移(P=0.0126)密切相关,而与年龄、性别、血清CA19-9与CEA水平、浸润深度及肿瘤分化情况无关(P>0.05)。3.ROC分析胆管癌与癌旁组织β6表达情况的结果表明,β6高表达时其可作为胆管癌诊断的免疫组化标记(曲线下面积AUC=0.876,P<0.001),其敏感性与特异性分别为78.95%、93.68%。ROC分析伴或不伴有淋巴结转移的胆管癌患者肿瘤组织中整合素β6表达情况的结果表明,当肿瘤组织免疫组化评分>5分时可有效预测淋巴结转移(AUC=0.701,P<0.001),其敏感性与特异性分别为77.55%及63.04%。结论及意义整合素β6在胆管癌组织中表达明显上调,且其表达情况与患者的淋巴结转移及远处转移情况密切相关。整合素β6可以作为诊断胆管癌的免疫组化标记物,且当肿瘤组织β6表达的免疫组化评分>5时,患者发生淋巴结转移的可能性大。故我们建议胆管癌手术切除标本常规行β6免疫组化染色,在辅助诊断胆管癌的同时,可用来预测患者淋巴结转移的情况以及推断肿瘤的恶性程度。该部分结果提示整合素β6可能在胆管癌侵袭转移过程中发挥重要作用,为进一步探讨整合素β6对胆管癌细胞恶行生物学行为的作用提供了一定的理论基础。第二部分整合素β6对胆管癌细胞恶性生物学行为的研究目的在确定整合素β6在胆管癌组织中表达明显上调且与淋巴结转移及远处转移密切相关后,明确整合素β6对胆管癌细胞的活性、增殖能力、迁移及侵袭能力等恶性生物学行为的作用。方法1.利用 quantitative Real-time PCR、Western blot 检测两种胆管癌细胞系 RBE 和QBC939细胞中β6的表达情况。2.分别将胆管癌细胞RBE及QBC939分为4组,对照组(NC)及β6干扰组(siβ6);空白质粒对照组(Mock)及β6过表达组(β6 transfectant)。分别利用quantitative Real-time PCR及Western blot在mRNA水平及蛋白水平检测干扰效果及过表达效果。3.采用CCK8法检测干扰或过表达整合素β6后胆管癌细胞RBE和QBC939活性的变化。4.采用MTT法检测干扰或过表达整合素β6后胆管癌细胞RBE和QBC939增殖能力的变化情况。5.利用细胞划痕实验及Transwell实验检测上述各组胆管癌细胞迁移能力的差异。6.利用预先包被Matri-gel的Transwel1侵袭小室检测干扰或过表达整合素β6后胆管癌细胞侵袭能力的变化情况。结果1.胆管癌细胞RBE及QBC939在mRNA水平和蛋白水平均中度表达β6,siβ6可显著降低两种细胞中整合素β6的表达,而转染整合素β6过表达质粒后可在mRNA及蛋白水平上检测到β6表达明显升高。2.CCK8实验表明干扰β6表达后,两种胆管癌细胞系细胞活性受到明显抑制,而过表达β6后,细胞活性显著增加。3.MTT实验证实,干扰整合素β6表达可显著抑制胆管癌细胞的增殖能力,反之过表达整合素β6则可促进胆管癌细胞的增殖。4.细胞划痕与Transwell实验结果表明,干扰整合素β6表达可显著抑制胆管癌细胞的迁移能力,而过表达整合素β6可促进胆管癌细胞的迁移。5.利用预先包被Matri-gel的Transwell小室我们发现干扰整合素β6表达后,胆管癌细胞的侵袭能力显著降低,而过表达整合素β6可明显提高胆管癌细胞的侵袭能力。结论及意义本部分内容旨在研究整合素β6对胆管癌细胞各项恶行生物学行为的影响。首先明确了 RBE与QBC939两种细胞系中在mRNA水平及蛋白水平均有中等量β6的表达,故进一步均对两种细胞进行了β6干扰及过表达处理,随后利用CCK8、MTT、细胞划痕及Transwell实验探究了β6对这两种胆管癌细胞的活性、增殖能力、迁移及侵袭能力的影响。本部分实验结果表明,整合素β6可以显著促进胆管癌细胞的活性、增殖能力、迁移能力及侵袭能力。该部分研究丰富了胆管癌发生发展的理论基础,也补充了整合素β6对在胆管癌作用研究方面的空白,并为进一步探究整合素β6促进胆管癌侵袭转移的具体机制研究打下了基础。第三部分整合素β6通过活化Rac1促进胆管癌细胞侵袭转移目的研究发现Rac1是肿瘤发生发展尤其是侵袭转移过程中的关键分子,在组织学及细胞学实验确定整合素β6与胆管癌侵袭转移密切相关后,探究整合素β6是否通过Rac1通路促进胆管癌细胞侵袭转移。方法1.干扰或过表达β6后,PAK-PBDβulldown实验检测细胞Rac1的活性。2.利用不同浓度的Rac1抑制剂处理胆管癌细胞RBE及QBC939,随后检测处理后胆管癌细胞迁移能力和侵袭能力的变化情况。3.胆管癌细胞RBE及QBC939利用50μM的NSC23766处理后,分别转染空白质粒及β6过表达质粒,Transwell检测两种胆管癌细胞迁移能力和侵袭能力的变化情况。4.胆管癌细胞RBE及QBC939均分为四组,分别共转染对照(NC)/Rac1小干扰RNA(siRac1)及空白质粒(Mock)/β6 过表达质粒(β6 transfectant),Transwell实验检测上述不同处理对胆管癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。5.Real-time PCR实验及ELISA实验分别检测干扰或过表达β6后两种胆管癌细胞中及细胞上清中uPA,MMP2,MMP3,MMP9表达量的变化。6.Real-time PCR实验及ELISA实验分别检测干扰Rac1表达后两种胆管癌细胞中及细胞上清中uPA,MMP2,MMP3,MMP9表达量的变化。7.NSC23766处理胆管癌细胞后,转染β6小干扰RNA或过表达质粒,ELISA实验检测胆管癌细胞上清中MMP9水平的变化。8.胆管癌RBE及QBC939转染β6小干扰RNA后,利用荧光标记的Phalloidin对细胞微丝骨架蛋白F-actin进行染色,共聚焦显微镜观察胆管癌细胞中微丝骨架蛋白F-actin聚合的情况。9.Rac1抑制剂处理胆管癌细胞后,转染整合素β6小干扰RNA或过表达质粒,利用荧光标记的Phalloidin对F-actin染色,共聚焦显微镜观察胆管癌细胞中F-actin聚合的情况。结果1.干扰β6表达后细胞Rac1活性降低,过表达β后细胞Rac1活性显著增强,β6的表达对细胞中Rac1总量的表达无显著影响。2.Rac1抑制剂NSC23766可显著抑制胆管癌细胞迁移及侵袭能力,且该抑制作用具有浓度依赖性。3.过表达整合素β6后胆管癌细胞的迁移及侵袭能力显著增强,但经过Rac1抑制剂处理后的对照组与整合素β6过表达组之间的差异消失,Rac1干扰RNA也有类似于NSC23766的效果。4.Real-timePCR结果显示,在胆管癌细胞RBE及QBC939中,干扰整合素β6的表达可显著降低胆管癌细胞mRNA水平MMP9的表达,而uPA、MMP2及MMP3表达无明显变化。过表达整合素β6可显著提高胆管癌细胞MMP9在mRNA水平的表达,对uPA、MMP2及MMP3表达无显著作用。5.ELISA实验结果显示,干扰β6可显著降低细胞蛋白水平MMP9的表达,过表达β6可显著提高细胞MMP9在蛋白水平的表达。6.Real-timePCR结果显示,在胆管癌细胞RBE及QBC939中,干扰Rac1的表达可显著降低细胞mRNA水平MMP9的表达,而对uPA、MMP2及MMP3表达无明显影响。7.ELISA实验结果显示,干扰Rac1表达可显著降低胆管癌细胞上清中MMP9的表达。8.ELISA实验结果显示,干扰β6可显著降低细胞上清中MMP9蛋白的表达,过表达β6可显著提高细胞上清中MMP9蛋白的表达,但经过NSC23766处理后,NC组与β6干扰组以及Mock组与β6过表达组之间MMP9蛋白表达的差异消失。9.Phalloidin荧光染色结果显示,NC组细胞中微丝丰富、形态规则、排列整齐,呈聚合状态,而β6干扰后微丝出现了明显的解聚。统计结果提示干扰整合素β6表达后可显著促进胆管癌细胞中F-actin的解聚。10.Phalloidin荧光染色结果显示,干扰β6可显著促进胆管癌细胞中F-actin的解聚,过表达β6可显著抑制细胞中F-actin的解聚,而经过Rac1抑制剂NSC23766处理后,不同处理组胆管癌细胞中F-actin解聚状态均明显增加,且整合素β6表达状况对F-actin解聚状态的影响消失。结论及意义本部分内容旨在探究整合素β6促进胆管癌侵袭转移的具体机制。首先直接证实整合素β6可以明显增强胆管癌细胞中Rac1的活性,而对细胞Rac1表达总量无明显影响,并利用不同浓度的Rac1抑制剂证实了 Rac1在胆管癌细胞的迁移侵袭过程中发挥重要的作用,进一步利用Rac1抑制剂及特异性小干扰RNA从两个角度证实Rac1参与了 β6调控的胆管癌细胞的迁移侵袭过程。随后我们发现β6可促进胆管癌细胞MMP9的表达,并进一步证实β6是通过Rac1通路发挥作用的。通过Phalloidin荧光染色我们证实β6可以显著促进细胞骨架蛋白F-actin的聚合,且该作用也是通过增强Rac1的活性而实现的。通过本部分实验内容,我们发现了β6促进肿瘤细胞迁移侵袭作用的一个关键靶点——Rac1,并证实了β6是通过活化Rac1促进F-actin的聚合及MMP9的分泌从而促进胆管癌细胞迁移侵袭的。鉴于Rac1在多种肿瘤侵袭转移过程中的发挥的关键作用,该发现无疑丰富了整合素β6的相关理论,并为研究整合素β6相关的靶向治疗药物来抑制胆管癌侵袭转移提供了理论基础。第四部分整合素β6促进裸鼠肿瘤的生长与肿瘤组织MMP9的表达目的在前期体外实验证实β6对胆管癌细胞迁移侵袭能力的促进作用及相应机制后,体内实验验证β6促进肿瘤发生发展的作用。方法1.分别构建整合素β6干扰慢病毒载体及过表达慢病毒载体;2.体外培养已转染整合素β6干扰慢病毒载体及过表达慢病毒载体的胆管癌细胞RBE,将其接种于裸鼠皮下建立裸鼠皮下成瘤实验模型,成瘤过程中测量肿瘤大小,绘制生长曲线。3.处死裸鼠后测量肿瘤体积与重量,并将肿瘤组织石蜡包埋后切片,免疫组化检测肿瘤组织中整合素β6和MMP9的表达情况。结果1.相对于对照组,整合素β6干扰慢病毒载体转染组肿瘤的生长速度明显减慢,同时肿瘤的体积和重量显著减小;而整合素β过表达慢病毒载体转染组肿瘤的生长速度明显加快,且肿瘤的体积和重量显著增加。2.免疫组化结果显示,相对于对照组,β6干扰慢病毒载体转染组肿瘤组织中β6表达显著降低,相应的MMP9表达也明显降低;而β6过表达慢病毒载体转染组肿瘤组织内β6表达显著升高,相应的MMP9表达也显著增高。结论及意义本部分是利用裸鼠皮下成瘤模型对前期体外实验的结论进行进一步的验证。该部分结果证实,β6不仅在体外细胞实验中可以明显促进胆管癌细胞的迁移侵袭,在体内实验中也可以明显促进裸鼠皮下肿瘤组织的生长,同时也可以增加肿瘤组织内MMP9的表达,提示高表达整合素β6的肿瘤组织有更强的侵袭转移能力。通过该部分研究我们进一步明确了整合素β6对胆管癌侵袭转移的促进作用。