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心肌炎是各种感染、物理和化学等多因素引起的心肌炎症损伤。心肌损伤会伴随邻近心肌细胞变性及坏死、肌球蛋白释放,进而继发自身免疫性心肌炎。自身免疫性心肌炎是导致炎性心肌病、心梗、心衰、心脏猝死的重要原因,严重威胁着青少年的健康。因此,阐明心肌炎症损伤过程与受损心肌纤维化的机制对于积极预防心血管疾病的发生,提高人民的生活质量具有重要意义。巨噬细胞(Macrophage,Mφ)是高度异质性细胞群体,广泛分布在机体各个组织器官,其在调节免疫应答、维持组织器官稳态、参与组织炎症损伤与组织修复中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinII,ANGⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin angiotensin aldosterone system,RAAS)重要的活性成分,广泛参与心肌炎等心血管疾病的发生发展以及心肌病的发生。ANGⅡ与受损心脏组织单核/巨噬细胞的浸润、功能的重塑以及心脏炎症消退有无关系?目的:心肌炎症损伤发生、发展阶段探讨:(1)ANGⅡ对单核/巨噬细胞趋化功能的影响;(2)ANGⅡ对受损心肌浸润单核/巨噬细胞的功能重塑的影响及其潜在的调控机制;(3)ANGⅡ对心脏炎症损伤后期阶段炎症消退的影响及其可能的机制。方法:1.ANGⅡ作为趋化因子促进EAM小鼠心肌单核/巨噬细胞浸润利用心肌肌球蛋白构建实验性自身免疫性心肌炎(Experimental autoimmune myocarditis,EAM)小鼠模型,(1)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测外周血血清以及心脏组织中ANGⅡ的表达;(2)氯沙坦(Losartan)灌胃处理EAM小鼠后,H(5)E染色观察心肌炎症浸润情况,qRT-PCR检测炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α以及趋化因子受体CCR2和CCR5的表达量;(3)腹腔注射CCR2/5的受体阻断剂观察EAM小鼠心肌炎症浸润以及病理评分情况,qRT-PCR检测炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α;(4)天狼星红染色(Sirius-red staining)检测心肌纤维化情况,qRT-PCR检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原(CollagenⅠ/Ⅲ)的表达量;(5)Transwell系统检测ANGⅡ对巨噬细胞的趋化功能。2.探讨ANGⅡ调控心脏浸润单核/巨噬细胞功能重塑参与心肌炎症发生的机制在EAM小鼠模型基础上,(1)qRT-PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达量,免疫荧光染色(Immunofluorescent,IF)检测不同处理组心脏组织中F4/80以及CD86双阳性细胞的表达,Sirius-red staining检测心肌纤维化情况;(2)流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测脾脏以及心脏组织中CD11b+Ly6Chi的表达;(3)流式细胞分选仪分选脾脏CD11b+Ly6Chi以及CD11b+Ly6Cint细胞,FCM检测CD11b+Ly6Chi细胞表面MHCII、F4/80、CD86的表达,Western-blot检测ANGⅡ刺激CD11b+Ly6Chi后iNOS的表达,ELISA检测ANGⅡ刺激CD11b+Ly6Chi以及CD11b+Ly6Cint细胞后上清液中炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达;(4)Western-blot检测ANGⅡ刺激RAW264.7后iNOS以及信号分子P38、Erk1/2、Stat3的磷酸化水平;磷酸化抑制剂处理后P38、Erk1/2、Stat3的磷酸化水平以及iNOS、Arg-1的表达;ELISA检测磷酸化抑制剂处理后上清液中炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达;(5)EAM模型鼠体内注射磷酸化抑制剂后,H(5)E染色观察心肌炎症浸润情况,Sirius-red染色检测心肌纤维化情况,qRT-PCR检测心脏组织中iNOS以及炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达;(6)EAM模型鼠静脉注射Agtr1siRNA后,H(5)E染色观察心肌炎症浸润情况以及病理评分情况,qRT-PCR检测心脏组织中炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量,IF检测不同处理组心脏组织中F4/80以及CD86双阳性细胞的表达,Sirius-red染色检测心肌纤维化情况。3.ANGⅡ活化的成纤维细胞诱导心脏M1型Mφ转化参与心肌炎症消退的机制ANGⅡ诱导小鼠心肌成纤维细胞(MCF)向肌纤维母细胞(MFB)活化后与巨噬细胞共培养,(1)共培养24h后Western-blot检测直接或间接共培养后MφiNOS以及凋亡相关分子Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3的表达,FCM检测Mφ表面CD86、MHCⅡ的表达以及细胞凋亡AnnexinV+PI+细胞比例;(2)ELISA检测MFB培养上清液中TNF-α的表达,FCM检测MFB细胞表面Fas/FasL的表达,Western-blot检测TNF-α介导的凋亡途径下游分子TNF-R1、TRADD、FADD、Cleaved-Caspase8的表达;TNF-α释放抑制剂C87作用后,FCM检测细胞凋亡比例,Western-blot检测TNF-α介导的凋亡途径下游分子TNF-R1、TRADD、FADD、Cleaved-Caspase8的表达;TNF-R1中和抗体使用后,Western-blot检测TNF-α介导的凋亡途径下游分子TNF-R1、TRADD、FADD、Cleaved-Caspase8的表达;(3)在EAM小鼠腹腔注射C87后,H(5)E染色观察心肌炎症浸润以及病理评分情况,qRT-PCR检测心脏组织中炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,IF检测不同处理组心脏组织中F4/80以及CD86双阳性细胞的数量;(4)共培养36h后Western-blot检测直接或间接共培养后MφArg-1的表达,ELISA检测IL-4、IL-10、TGF-β1的表达,qRT-PCR检测Arg-1、Retnla、Chil3、Mrc1的表达,FCM检测Mφ表面CX3CR1以及细胞凋亡AnnexinV+PI+细胞比例;(5)ELISA检测各组细胞上清液中Leptin的分泌,Western-blot检测Leptin处理Mφ后Arg-1以及信号分子PI3K/AKT的磷酸化水平;Leptr-/-缺陷鼠运用后Western-blot检测Arg-1的表达,ELISA检测上清液IL-10以及TGF-β1的表达;(6)IF检测不同阶段EAM小鼠心脏组织中AnnexinV+F4/80+以及CX3CR1+F4/80+双阳性的细胞的数量,过继转移验证脾脏以及心脏组织中CD45.2+CCR2+CX3CR1+的细胞比例。结果:1.(1)EAM小鼠外周血血清以及心脏组织细胞悬液中ANGⅡ的表达明显高于正常对照(P<0.05);(2)氯沙坦处理组较EAM组心肌炎症浸润明显缓解,炎症评分明显下调(P<0.05),心脏组织炎症介质以及趋化因子CCR2/5表达均下调(P<0.05);(3)体内CCR2/5受体阻断剂处理小鼠后心脏组织炎症介质表达减低(P<0.05),(4)纤维化明显缓解,胶原表达也下调(P<0.05);(5)体外CCR2/5受体阻断剂处理后相较于ANGⅡ处理组趋化功能明显减弱(P<0.01)。2.氯沙坦处理EAM小鼠后:(1)心脏组织中iNOS以及MCP-1表达量相较于EAM组明显减低(P<0.05),免疫荧光显示浸润的炎性巨噬细胞F4/80+CD86+(M1)数量减少(P<0.05)同时纤维化程度缓解(P<0.05);(2)FCM结果显示氯沙坦处理EAM小鼠后较EAM组脾脏CD11b+Ly6Chi下调明显(P<0.05),心脏组织具有同样的效果(P<0.05);(3)ANGⅡ处理CD11b+Ly6Chi后结果显示其抗原提呈功能增强,iNOS表达上升,上清炎症介质分泌增加(P<0.05);(4)Western-blot结果显示ANGⅡ通过P38/Erk1/2/Stat3途径活化巨噬细胞,磷酸化抑制剂处理后明显阻断活化途径同时上清液中炎症介质表达也减低(P<0.05);(5)体内磷酸化抑制剂处理后心肌炎症浸润减弱并且评分减低(P<0.05),纤维化缓解,炎症介质表达下调(P<0.05);(6)Agtr1 siRNA注射后同样显示心肌炎症浸润减弱并且评分减低(P<0.001),炎症介质表达下调(P<0.01),IF显示浸润的M1数量减少(P<0.05),纤维化缓解(P<0.05)。3.ANGⅡ诱导小鼠心肌成纤维细胞(MCF)向肌纤维母细胞(MFB)活化后与巨噬细胞共培养:(1)MFB与Mφ共培养24h后诱导Mφ向M1型Mφ转化,其抗原提呈功能增强并伴随有M1型Mφ发生凋亡,凋亡相关分子Bax、Bcl-2以及Cleaved-Caspase3蛋白水平上调(P<0.05);(2)MFB诱导M1型Mφ发生凋亡依赖TNF/TNF-R1途径而非Fas/FasL所介导,其下游相关蛋白TNF-R1、TRADD、FADD、Cleaved-Caspase8表达升高(P<0.05),TNF-α释放抑制剂C87作用后凋亡蛋白表达明显下调,TNF-R1中和抗体应用后具有同样现象;(3)体内应用C87后心肌炎症浸润缓解并且评分明显减低,炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α表达下调(P<0.05),IF检测表明M1数量也明显减少;(4)MFB与Mφ共培养36h后Mφ向M2型Mφ转化,M2相关的介质表达升高并且高表达CX3CR1,同时也不伴有凋亡现象发生;(5)ELISA检测M1、M2、MFB均高表达Leptin(P<0.05),Leptin可活化PI3K/AKT信号途径上调Arg-1的表达,MFB不会诱导Leptr-/-的Mφ表达Arg-1,M2相关因子IL-10、TGF-β1未见上调;(6)EAM小鼠21d心脏组织AnnexinV+F4/80+数量增加,35d心脏组织中CX3CR1+F4/80+数量增加,过继转移结果显示脾脏和心脏CD45.2+CCR2+CX3CR1+的细胞比例上调。结论:ANGⅡ能够招募单核/巨噬细胞浸润至心肌损伤部位并通过Erk1/2、P38/Stat3通路调控心脏浸润单核/巨噬细胞功能重塑参与EAM炎症损伤;ANGⅡ通过诱导心肌成纤维细胞活化从而调控浸润炎性巨噬细胞向M2型转化参与EAM的炎症消退。