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自人们首次分离到生产L-谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌以来,非致病性土壤棒杆菌的三个主要代表种:谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌,已经被广泛用于氨基酸的工业化生产。目前代谢工程育种已经成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。可应用于棒状杆菌的载体系统,是棒状杆菌分子生物学研究以及代谢工程育种的基础。由于自身存在缺点,已有的棒状杆菌载体在某些情况下不适合用于代谢工程研究。本研究主要进行了新的黄色短杆菌载体系统的构建工作,并进行了黄色短杆菌产L-缬氨酸代谢工程育种的初步研究。主要研究结果如下:(1)构建了一个新型E. coli–B. flavum穿梭型诱导表达载体pDXW-8。pDXW-8有如下特点:pDXW-8具有大肠杆菌复制起点oriE,棒状杆菌双链复制起点dso及单链复制起点sso;具有两个抗生素抗性标记?青霉素抗性基因amp和卡那霉素抗性基因kan;使用tac启动子表达目的基因;使用lacIPF104来控制tac启动子的转录;具有一个长的多克隆位点MCS。与已经存在的棒状杆菌表达载体相比,pDXW-8最主要的优点有两个:一是它的MCS包含多达11个单限制性内切酶切点,这保证了载体可以非常方便地用于克隆携带许多限制性内切酶位点的DNA片段以及同一代谢途径中的多个基因;另一个主要优点是lacIPF104基因可以严格控制tac启动子的转录,确保了有毒基因在棒状杆菌中的诱导表达。在大肠杆菌、黄色短杆菌和谷氨酸棒杆菌中使用载体pDXW-8表达vhb基因的实验证明:pDXW-8是一个适用于棒状杆菌代谢工程研究的新型载体。(2)构建了一个新的大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭型启动子探测载体pDXW-11。pDXW-11具有大肠杆菌复制起点oriE,棒状杆菌双链复制起点dso及单链复制起点sso;使用卡那霉素抗性基因作为筛选标记。启动子探测相关区域有如下特性:rrnBT1T2终止子紧邻多克隆位点MCS,位于其上游,这阻止了MCS上游潜在启动子的转录通读;包含7个单切点序列的MCS位于报告基因cat的上游;MCS和cat之间具有三个串联的终止密码子,这阻止了潜在的插入片段的翻译通读。在黄色短杆菌中应用pDXW-11检测了6个启动子,其活性从强到弱的依次为:tac-M, Pkan, tac-M1, tac, PF104和PilvA。这些启动子,尤其是强启动子tac-M,对于棒状杆菌代谢工程研究具有非常重要的意义。(3)构建了一个新型E. coli–B. flavum穿梭组成型表达载体pDXW-10。pDXW-10有如下特点:具有大肠杆菌复制起点oriE,棒状杆菌双链复制起点dso及单链复制起点sso;具有卡那霉素抗性基因kan;具有一个长的多克隆位点MCS;使用tac-M启动子表达目的基因。与已有的棒状杆菌表达载体相比,pDXW-10有如下优点:首先,长的MCS非常方便用来克隆DNA大片断;第二,在tac-M启动子的控制下,插入的目的基因进行中度水平的表达,而中度水平的酶量非常适合于细胞代谢产物的生产;第三,是克隆在载体中的基因在棒状杆菌中实施组成型表达,这非常有益于工程菌株的大规模工业化发酵生产目的产物;第四,在E.coli中使用pDXW-10表达目的基因时仍需要IPTG的诱导,这将有助于克隆那些用于棒状杆菌代谢工程改造而对E. coli细胞有毒性的基因。在大肠杆菌和黄色短杆菌中应用载体pDXW-10表达氯霉素酰基转移酶CAT,结果CAT在大肠杆菌呈现高水平表达,在黄色短杆菌呈现中度水平表达。pDXW-10是用于棒状杆菌代谢工程研究的一个理想的表达载体。(4)初步构建了可应用于黄色短杆菌基因无痕敲除和替代的整合型载体pDXW-3。通过转化实验证明已有的用于棒杆菌基因敲除及替代的整合型载体pK18mobsacB在黄色短杆菌B. flavum ATCC14067中转化效率非常低,不能用于黄色短杆菌基因的无痕敲除和替代研究。pDXW-3能高效转化B. flavum ATCC14067,以kan作为正向筛选标记,使用lac-M启动子的sacB基因作为反向筛选标记,可用于黄色短杆菌基因无痕敲除和替代。(5)初步构建了一株过量积累L-缬氨酸的黄色短杆菌工程菌株。从谷氨酸棒杆菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032中克隆出L-缬氨酸合成途径上的限速酶-乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B. flavum ATCC14067 ,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L罐发酵试验结果显示:在野生型菌株发酵液中检测不到L-缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L-缬氨酸积累达5.0 g/L。