研究背景传统针灸学将腧穴定义为人体脏腑经络之气输注于体表的特殊部位,既是反映疾病的门道,又是针灸的施术部位。这里虽然提到了特殊部位,但是对其中的具体结构未做详细的描述。现代研究则认为腧穴是由一系列已知结构,如神经、血管等,按一定规律进行空间布局和立体构筑所组成的一个综合体。腧穴是针刺刺激的初始应答部位,针灸效应的产生与皮肤的结构和功能密不可分。皮肤由表皮(epidermis)、真皮(dermis)、皮下(subcuits)组织构成。其不同层次内含有各种具有不同生理功能的细胞如角质形成细胞、黑素细胞(melanocyte)、朗格汉斯细胞(Langerhans cells,LCs)和Merkel细胞。皮肤免疫系统(skinimmune system,SIS)可分为细胞与体液两大部分。细胞成分包括角质形成细胞、LCs、树突状细胞以及巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞、肥大细胞及内皮细胞等。体液成分有肽类、补体、分泌型免疫球蛋白及细胞因子等。对于腧穴结构的探索经历了从宏观到微观几个不同的认识阶段。过去研究者们觉得人体上的穴位大多位于神经末梢密集集中或有较粗神经纤维经行之处,但是关于对其具体结构的描述尚无明确定论。目前为止,我们对腧穴相关的组织结构还缺少深入系统的研究。过去通过肉眼对体表的观察和局部解剖后的宏微观解析,或是借助各种显微镜对组织切片上进行的微观图像记录和分析,我们观察到的腧穴是由多元已知成分组成的组织结构,它们是针灸过程中能够直接接触或作用的载体,并借此发挥生物学效应。综合来看,近几十年来研究者将对穴位结构研究的重点大多放在穴位的体表定位及其大体组织结构上,而缺少对其中的细胞分类和它们所包含的化学成分方面的深入研究。既然我们还无法确认与腧穴相对应的特定结构的存在,那么从已知的组织结构入手研究与腧穴相关的细胞分类及其化学特征就自然成为腧穴生物学基础研究的选择。目前,随着组织学研究技术的发展和进步,为我们从组织学水平深入研究腧穴的显微结构提供了更多有效的方法,也为我们能够更好地探究腧穴相关的组织结构创造了条件。皮肤接受针灸刺激后发挥生物学效应的部位与其微循环结构、神经末梢以及细胞生物活性成分的关系非常密切。尽管穴位的选取和刺激的方式对针灸疗效的获得起着至关重要的作用,但是系统深入地了解腧穴的生物学基础及显微结构,有助于我们更好地解释针刺效应产生的机制。我们需要注意的是由于腧穴所在部位的不同,它们在皮肤的厚度、肌肉组织的多少、血管和神经分布的疏密等方面也存在很多差异。因此为了更加深入地了解腧穴的生物学基础,我们要将重点放在腧穴结构相关的组织化学研究上。接受刺激后腧穴局部的生物活性物质会发生相应改变,正是这种变化启动了机体自稳态的调控以及一系列相应级联反应的发生,从而达到治愈疾病的目的。由此反映出针灸具有调控和维持人体功能稳态的效应。针灸刺激穴区处皮肤可以出现针感及所谓“得气”“循经感传”效应,该兴奋可以通过穴区内的各种结构向中枢传递,其中血管壁及其周围的交感神经末梢的兴奋冲动,在循经感传的产生以及“穴位—脏腑相关”调节效应中起到了关键性作用。穴区局部的神经纤维的密度、血管及淋巴管的分布、各种免疫细胞功的激活和相关化学物质的产生是针刺效应产生的生物学基础。血管与淋巴管作为局部的免疫微环境是穴区免疫发生的前提:当机体受到损伤后,淋巴液中会出现一些化学活性物质如炎症及血管反应介质等,这些化学介质可能在针刺效应中起着关键性作用。同时,针灸对腧穴局部组织产生机械和化学刺激,可能借助附近的外周感受器和游离神经纤维将针刺信号经神经上行系统上传到中枢,然后通过各级中枢的整合及反射,对躯体和内脏功能活动进行调控。作为皮肤神经-免疫-内分泌网络中的重要一环,淋巴管与微血管所参与的体液调节和细胞免疫在阐释针刺作用机制中发挥重要作用。因此提示我们研究腧穴局部组织中神经纤维、血管、淋巴管和免疫细胞在腧穴局部组织中的相互联系的特征,可以作为从细胞水平上解释针刺的经络效应的一个关键突破口。大脑与皮肤之间的交流是由内分泌系统中一些激素所介导的,每种激素均发挥自己的调节作用。其中肥大细胞不仅是各类激素作用的靶细胞,同时还可以释放多种炎症介质,在介导神经-免疫-内分泌网络中的联络桥梁中发挥了关键作用。大脑通过“下丘脑-垂体-肾上腺(中央HAP轴)”和“交感神经肾上腺髓质(SAM轴)”实现与皮肤的交流和联系;同时,皮肤的不同部位也可以分泌类似的激素,形成皮肤局部调控的微环境(外周HAP轴)。肥大细胞在人体中普遍存在,主要分布在血管周围,尤其是在与血管、神经等相接触部位,能对附近神经元产生的神经肽作出特定反应,激活脱颗粒并且还可以诱导细胞因子和趋化因子的产生。在接受针灸信号之后,肥大细胞通过脱颗粒释放炎性介质将机械刺激转化成生物信号,再经过神经-内分泌-免疫网络的整合、传导,使反馈调节作用于靶器官,因而达到即气至病所的效果。针刺与艾灸的共同作用部位均为腧穴,但两者的刺激方式是不同的,艾灸主要是通过艾绒燃烧的温热刺激作用于人体,而针刺则以针具施以手法的机械性刺激为主。针灸既可以增加穴区局部肥大细胞的数量,引起循经聚集效应,又可以刺激使其脱颗粒,释放组胺、5-羟色胺,肝素等。这些介质不仅可以增加血管的通透性,又可以引起局部水肿以及轻度的自发性炎症反应。一方面,这可能通过诱导黏附分子和趋化因子促进肥大细胞在病灶等部位向穴位聚集;另一方面,它可以激活免疫系统,扩大局部针灸作用到整个身体。研究目的与意义1.通过研究不同穴区与非穴区皮肤的机械痛阈,揭示不同腧穴与非穴是否存在感觉差异。2.通过观察腧穴相关局部组织中神经纤维、血管和免疫细胞之间的交互联系,揭示腧穴相关组织化学在结构和功能上的联系。3.通过研究针刺与艾灸对穴区肥大细胞活化状态的影响,揭示针刺与艾灸对机体的作用的差异。研究方法痛阈检测:根据文献记载穴位区域的定位是以穴位为中心1 cm×1 cm的皮肤肌肉组织,而非穴位区域的定位则在穴位左侧或右侧旁开1.5 cm处1 cm×1 cm的皮肤肌肉组织组织。通过人体与大鼠相应比列的折算,确定本次实验的非穴对照。分别从大鼠头面、躯干、四肢选取代表性腧穴:非穴1(大鼠百会和天门穴连线中点)、阳白(大鼠目正中直上,骨骼上方凹陷处)、非穴2(大鼠曲池穴旁5mm处)、外关(腕关节上3 mm,尺桡骨之间)、环跳(后肢髋关节后上缘)、太冲(后肢足背第一、二跖骨间凹陷处)。在大鼠静息30 min后开始测试,手持测量仪的刺激针头刺激大鼠不同腧穴穴区皮肤,逐步增加刺激力度,直至大鼠有回避反应,记录该刺激强度。每两次测试之间需间隔10 min,测量三次并记下每次的数据。针刺与艾灸的对比研究:将清洁级健康雄性Sprague Dawley大鼠24只,体质量(220±20)g,随机分为空白对照组、针刺组和艾灸组,每组8只。大鼠在麻醉状态下,针刺组选用0.25 mm× 15 mm针灸针,直刺入“太冲”穴皮肤1.5 mm,以均一频率(120次/min)小幅度连续捻转10 min;艾灸组选用线香代替艾条在距离穴位皮肤1cm处,使施灸穴位局部皮温保持41±0.2℃,持续施灸10 min。干预结束后将大鼠经依次灌入0.9%氯化钠溶液和含有4%多聚甲醛以及0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PB,pH 7.4)的固定液。取出穴区皮肤组织,并制作成组织切片,经免疫荧光组织化学染色后通过共聚焦显微镜进行观察分析。研究结果痛阈检测结果:穴位和非穴(阳白与非穴1、外关与非穴2)之间的痛阈并没有明显的差异存在(P>0.05);头面以及肢体末端穴位与非穴(阳白,非穴1,太冲)的对疼痛的耐受度明显低于躯干及四肢近躯干部的穴区与非穴区域(外关,非穴2,环跳),其差异具有统计学意义(P<0.05)。躯干部的环跳穴对疼痛的耐受程度明显高于其他穴区及非穴区(P<0.01)。针刺与艾灸的对比研究结果:针刺和艾灸干预后大鼠“太冲”穴区皮肤组织中NPY、TH、CGRP阳性神经纤维的含量增多以针刺的变化更为明显,说明两者对穴区局部组织的差异性调节体现在对神经肽的调节上;针刺与艾灸均可以促进肥大细胞的激活(P<0.05)但两者之间差异不显著(P>0.05);针刺组对激活型肥大细胞的脱颗粒比率要明显高于空白对照组(P<0.05),而艾灸组与针刺组之间没有明显差异(P>0.05);针刺与艾灸均能促进5-HT和HA的表达(P<0.05),而两者之间的差异不显著(P>0.05)。研究结论1.头面及肢体远端穴位的痛阈明显低于躯干部;穴位和非穴之间的痛阈没有明显差异。2.针刺和艾灸刺激均能引起表皮神经纤维中NPY、TH、CGRP的表达增强,进而激活肥大细胞,通过释放5-HT和HA产生级联效应,这些神经活性成分可能在将针灸信号放大和传递过程中起到了介导作用,并发挥生物学效应。3.针刺与艾灸对穴区局部组织中肥大细胞均具有激活作用并能促使其发生脱颗粒,在肥大细胞脱颗粒方面针刺强于艾灸。