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Zhangfei(ZF),又称为CREBZF,是目前发现的第二个能够与HSV-I相关联的宿主细胞因子HCF-1(Host Cell Factor-1)相互作用的碱性亮氨酸拉链(basic region leucine zipper ,bZIP)转录因子,Zhangfei通过与ATF4形成异二聚体参与哺乳动物的未折叠蛋白应答反应(unfolded protein response ,UPR)。进一步研究Zhangfei基因的转录、翻译调节机制及其蛋白功能对于深入了解其在UPR途径中的调节机制具有重要的理论意义。因此,本研究在构建了相关载体的基础上,应用实时定量PCR、双荧光酶检测系统、Western blotting和染色体免疫沉淀等技术对Zhangfei的转录和翻译调控机制进行了研究,获得以下结果:1.通过分析Zhangfei基因的序列结构,发现在Zhangfei基因mRNA 3′端存在213bp的选择性剪切位点,通过对该位点的选择性剪切可在C端形成携带IFFFR和不携带IFFFR的两种蛋白亚型;此外,Zhangfei基因还存在两个不同的翻译起始位点ATG,选择性翻译起始在第一个ATG开始可在N端添加82个氨基酸,而在第二个ATG开始则缺少N端的82个氨基酸;因此,Zhangfei可以产生4种蛋白亚型:lZF、lZF-IFFFR、sZF和sZF-IFFFR。此外,还以pGL3-Basic为基本载体,构建了包含不同长度Zhangfei启动子的荧光表达载体。2.用包含不同长度的Zhangfei启动子的荧光表达载体转染MDCK细胞24 h后,检测双荧光酶的活性可知,Zhangfei启动子区的-1767—-1112bp对Zhangfei基因的基本转录激活起着重要的作用,但是该区域不能应答化学药物Tunicamycin (Tm)和Thapsigargin(Tg)引起的应激;pGL3-ZF-A转染MDCK细胞24 h后更换培养液,继续培养24 h后通过检测发现,培养液中谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸或蛋氨酸缺失可以诱导Zhangfei启动子的转录,尤其是亮氨酸缺失能够大幅度增强Zhangfei的转录活性;进一步用包含Zhangfei启动子序列缺失的表达载体转染MDCK细胞并测定其荧光酶活性,发现位于Zhangfei启动子区9bp的顺式作用元件5′-ATTCACTCA-3′对于氨基酸缺失引起的转录激活是必不可少的,序列比对表明该序列与目前已知的氨基酸应答元件(AARE)序列存在极高的同源性。3.以pcDNA3.1为基本载体,分别将编码lZF、lZF-IFFFR、sZF和sZF-IFFFR的cDNA序列克隆到pcDNA3.1中,形成能够表达Zhangfei 4种不同亚型蛋白的表达载体,Western杂交表明这4种载体都能表达相对应的亚型蛋白;通过对lZF和lZF-IFFFR的第二个ATG进行序列变异产生lZF-M83I和lZF-IFFFR-M83I,发现lZF和lZF-IFFFR能通过选择性翻译起始分别产生sZF和sZF-IFFFR;用Tm处理Hela细胞0 h、24 h和48 h后,提取总RNA、细胞总蛋白后进行实时定量PCR和Western杂交,表明内质网应激因子Tm不仅可以增强Zhangfei mRNA的表达,而且可大量诱导内源性的sZF-IFFFR蛋白表达;当在亮氨酸缺失的细胞培养液中培养Hela细胞0 h,24 h,48 h和72 h,发现72 h氨基酸缺失能够大量诱导sZF-IFFFR表达。4.通过用包含CHOP启动子的荧光表达载体和能表达4种不同Zhangfei亚型蛋白的表达载体共转染Hela细胞后,收获蛋白并进行双荧光酶活性检测,发现lZF-IFFFR和sZF-IFFFR通过CHOP启动子区的(C/EBP)-ATF元件,显著增强CHOP的转录和翻译;用shRNA技术干扰sZF-IFFFR蛋白的表达后,发现CHOP的转录活性明显降低,表明sZF-IFFFR能够与CHOP启动子区的(C/EBP)-ATF元件相结合促进CHOP的转录激活;染色体免疫沉淀结果也证实sZF-IFFFR能够在体外特异性地与CHOP启动子区的(C/EBP)-ATF元件相结合;通过测定caspase-3的活性,表明lZF-IFFFR和sZF-IFFFR可通过激活CHOP的表达而诱导细胞凋亡。总之,本研究发现了Zhangfei蛋白的4种亚型和位于Zhangfei启动子区的AARE序列,并提出lZF-IFFFR和sZF-IFFFR是在CHOP诱导的细胞凋亡途径中出现的两个新的细胞转录因子。