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控制性超排卵(controlled ovary hyperstimulation,COH)是体外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)周期的重要组成部分,已有研究证实COH可能破坏卵细胞中染色体的结构,影响染色体的功能,导致细胞中某些基因的表达缺陷,对卵细胞的发育起负面影响,降低胚胎的质量和其着床能力。因此COH能导致胚胎着床率和妊娠率处于明显低下的水平。中医药介入IVF-ET周期收效显著,我们前期研究证实益气血补肝肾中药能提高胚胎移植成功率和妊娠率。本文主要研究经后增殖方对COH卵巢卵丘细胞(cumulus cells,CCs)凋亡的影响。人CCs与卵母细胞有密切的关系,CCs能直接影响卵母细胞的发育和成熟,影响胚胎的质量,而卵母细胞也可以分泌卵细胞分泌因子(oocyte secreted factors,OSFs),通过旁分泌的作用来调节周围CCs的生长和分化。在卵母细胞的成熟过程中,两者互为影响,缺一不可。生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)是转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)超家族中一个重要的成员,作为卵母细胞分泌的细胞因子,GDF9与卵细胞的发育和发展具有密切关系,是与卵泡发育有关的重要调节因子,卵泡液中的GDF9已经作为一项重要指标,用于对卵母细胞和胚胎质量的预测。Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death)是 Bcl-2 家族中的成员,隶属于BH3-only亚家族。Bim在机体多种组织包括生殖细胞中有不同程度的表达,在启动凋亡和调节凋亡上具有重要的作用,是一种重要的凋亡调节蛋白。本文主要探讨益气血法经后增殖方通过调节GDF9分泌和Bim表达抑制COH卵巢CCs凋亡的作用机制,同时对其可能的信号通路进行验证,为其广泛的临床应用提供分子理论基础。期望能找到改善IVF-ET中卵母细胞质量及发育潜能的途径,进一步提高IVF-ET临床胚胎种植率与妊娠率。目的:观察益气血法经后增殖方对COH大鼠卵巢GDF9和Bim分泌的影响,探讨经后增殖方在抑制COH卵巢CCs凋亡中的作用机制,并对其可能的信号通路进行验证。方法:1动物实验研究通过建立COH大鼠模型,同时应用经后增殖方进行干预,以自然排卵大鼠作为空白对照,以COH大鼠作为阳性对照,采用TUNEL和qPCR技术检测不同剂量经后增殖方干预的COH大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率及卵巢组织中Bim基因的表达水平。2细胞实验研究2.1通过制备不同浓度经后增殖方含药血清,,对COH大鼠卵巢颗粒细胞体外培养进行干预,采用qPCR技术检测颗粒细胞中Bim基因的表达水平,选出含药血清最佳作用浓度和时间,应用于后续实验。2.2建立COH大鼠模型,获取卵巢COCs和CCs进行体外培养,用经后增殖方含药血清和GDF9受体阻断剂进行干预,采用qPCR和Westernblot技术检测COCs和CCs中GDF9基因和蛋白及Bim基因的表达水平。2.3建立COH大鼠模型,获取卵巢COCs进行体外培养,用经后增殖方含药血清和PI3K、PKA、p38MAPK、SMAD和NF-κ B通路阻断剂进行干预,采用qPCR和Westernblot技术检测COCs中GDF9基因和蛋白及Bim基因的表达水平。结果:1经后增殖方对COH大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率及卵巢组织中Bim基因表达的影响1.1经后增殖方可降低COH大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率中药低、中、高剂量组均明显低于阳性对照组(均为P<0.05),中药高剂量组与空白对照组比较无显著差异(均为P>0.05),说明高、中、低剂量经后增殖方均可降低COH大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率,且高剂量经后增殖方能使COH大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率达到接近自然排卵大鼠的水平;中药低、中、高剂量组卵巢颗粒细胞凋亡率逐渐下降,且各剂量组之间均有显著差异(P<0.01),说明COH大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率凋亡率与经后增殖方剂量呈负相关。1.2经后增殖方可降低COH大鼠卵巢组织Bim基因的表达中药低、中、高剂量组均明显高于空白对照组(均为PM0.05),明显低于阳性对照组(均为P<0.05),说明高、中、低剂量经后增殖方均可降低COH大鼠卵巢组织Bim基因的表达水平;中药低、中、高剂量组Bim mRNA相对表达水平逐渐下降,但无显著差异(均为P>0.05),说明高、中、低剂量经后增殖方降低COH大鼠卵巢组织Bim基因的表达水平的作用相当。2经后增殖方含药血清经p38MAPK和NF-κ B通路的调控调节GDF9和Bim表达抑制COH大鼠卵巢CCs凋亡2.1经后增殖方含药血清抑制COH大鼠卵巢颗粒细胞Bim基因表达的最佳作用浓度和时间24小时中药低、中、高剂量组明显低于空白血清组(均为P<0.01),说明高、中、低剂量经后增殖方含药血清干预24小时后Bim基因的表达水平均有显著下降;中药低、中、高剂量组BimmRNA相对表达水平逐渐下降,且各组间均有显著差异(均为P<0.01),说明经后增殖方含药血清降低Bim基因表达水平的效果与浓度呈正相关,高剂量的效果最优。48小时中药低、中、高剂量组Bim mRNA相对表达水平逐渐下降,中药高剂量组明显低于其他3组(均为P<0.05),其他3组之间无明显差异(均为P>0.05),说明仅高剂量经后增殖方含药血清在干预48小时仍能维持Bim基因表达的低水平,而中、低剂量经后增殖方含药血清48小时干预效果并不理想。结合以上结果,筛选出经后增殖方含药血清抑制卵巢颗粒细胞凋亡的最佳作用时间为24小时,最佳作用浓度为高剂量。2.2经后增殖方含药血清对COH大鼠COCs和CCs中GDF9和Bim表达的调节2.2.1经后增殖方含药血清能提高COH大鼠COCs和CCs中GDF9基因和蛋白的表达COCs-含药血清组GDF9基因相对表达量明显高于COCs-空白血清组和COCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组(均为P<0.05),CCs-含药血清组GDF9基因相对表达量明显高于CCs-空白血清组和CCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组(均为P<0.05),说明经后增殖方含药血清能提高COH大鼠COCs和CCs中GDF9基因的表达。COCs-含药血清组GDF9蛋白相对表达量明显高于COCs-空白血清组(P<0.05),高于COCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组,但差异无统计学意义(P>0.05);CCs-含药血清组GDF9蛋白相对表达量明显高于CCs-空白血清组和CCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组(均为P<0.05),说明经后增殖方含药血清能提高COH大鼠COCs和CCs中GDF9蛋白的表达。COCs-含药血清组GDF9基因相对表达量明显高于CCs-含药血清组(P<0.05),说明COCs较去除卵母细胞的CCs更有利于GDF9的表达。2.2.2经后增殖方含药血清能抑制COH大鼠COCs和CCs中Bim基因的表达COCs-含药血清组和COCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组Bim基因相对表达量均明显低于COCs-空白血清组(均为P<O.05),CCs-含药血清组和CCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组Bim基因相对表达量均明显低于CCs-空白血清组(均为P<0.05),说明经后增殖方含药血清能抑制COH大鼠COCs和CCs中Bim基因的表达。COCs-含药血清组Bim基因相对表达量低于COCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组,但差异无统计学意义(P>0.05),CCs-含药血清组Bim基因相对表达量明显低于CCs-含药血清+GDF9受体阻断剂组(P<0.05),说明由于受GDF9受体阻断剂作用,GDF9的表达明显降低,从而无法维持Bim表达的低水平,验证了 GDF9有维持CCs中Bim表达的低水平的作用。2.3经后增殖方含药血清对COH大鼠COCs中GDF9和Bim表达的调节是通过p38MAPK和NF-κB通路介导的含药血清+PI3K inhibitors组、含药血清+PKA inhibitors组、和含药血清+SMAD inhibitors组GDF9基因和蛋白的相对表达量均明显高于空白血清组(均为P<0.05),与含药血清组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05);含药血清+p38MAPK inhibitors组和含药血清+NF-κ B inhibitors组GDF9基因和蛋白的相对表达量均明显低于含药血清组(均为P<0.05),与空白血清组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。说明经后增殖方含药血清能提高COH大鼠COCs中GDF9基因和蛋白的表达水平,该作用是通过p38MAPK和NF-κ B通路介导的。含药血清+PI3K inhibitors组、含药血清+PKA inhibitors组和含药血清+SMAD inhibitors组Bim基因相对表达量明显低于空白血清组(均为P<0.05),与含药血清组比较,差异无统计学意义(均为P>0.05);含药血清+p38MAPK inhibitors组和含药血清+NF-κ B inhibitors组Bim基因相对表达量明显高于含药血清组(均为P<0.05),与空白血清组比较,差异无统计学意义(均为P>0.05)。说明经后增殖方含药血清能降低COH大鼠COCs中Bim基因的表达水平,该作用可能是通过p38MAPK信号通路和NF-κ B信号通路介导的。结论:①益气血法经后增殖方能通过促进COH大鼠卵巢COCs中卵母细胞分泌GDF9,而GDF9通过旁分泌作用周围的CCs,维持CCs的低凋亡率而改善COCs的功能,从而提高卵细胞质量;②益气血法经后增殖方能通过多途径抑制COH大鼠卵巢COCs和CCs中Bim的表达水平,途径之一是通过促进GDF9的分泌以维持Bim表达的低水平,从而抑制CCs凋亡;③益气血法经后增殖方对COH大鼠卵巢COCs和CCs中GDF9和Bim表达的调节是通过p38MAPK和NF-κB信号转导通路介导的。