每年全球范围内有多达百万女性罹患癌症,其中大约10%的女性患者在育龄期。化学治疗的应用使癌症患者的生存率明显提高,约90%年轻的早期癌症患者在治疗后可以存活,但是化学治疗引起的远期并发症的风险却不可忽视。其中,最突出的远期影响包括因为化学治疗所引起的原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)或卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)所致的早绝经和不育,极大地影响育龄期患者的生存质量。因此,在不妨碍癌症治疗的原则上,提高此类患者的生存质量、保护卵巢功能和生育力已经成为临床上医生与患者共同面临的难题。基础实验及临床病例表明,在杀灭癌症细胞的同时,许多化学治疗药物可以不同程度地损伤卵巢功能、使卵巢结构紊乱、卵巢纤维化明显、影响卵泡的启动、生长发育及成熟过程,但其具体机制仍不十分清楚。目前,临床上预防或者治疗化疗相关卵巢功能不全主要的方法有:促性腺激素释放激素类似物治疗、性激素替代治疗及生育力冷冻保存技术。促性腺激素释放激素类似物治疗预防化疗引起的卵巢功能不全目前只在乳腺癌中观察到有一定效果;性激素替代治疗只能改善患者的围绝经期症状,不能改善卵巢功能及生育能力;而生育力冷冻保存技术受到患者年龄、身体状态及婚姻状态等的制约,因此每种方法都有其局限性,尚不能广泛应用于临床。随着再生医学的兴起及发展,干细胞已经在多种疾病中证实有组织修复及组织再生的作用。目前,多个研究表明,干细胞移植在改善卵巢功能、修复卵巢组织结构及促进生育力方面具有一定的作用,但其机制仍不清楚。近年来,人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,h AECs)的发现及研究为再生医学领域指引了新的研究方向。由于羊膜为医疗废物、来源丰富、获取简单、无道德伦理的制约,且h AECs具有一定干细胞特性、免疫原性低且未发现致瘤性,因此h AECs在再生医学领域具有广阔的应用前景,有望成为修复化疗所致卵巢功能不全的新方法。据报道,h AECs可以分泌多种细胞因子,这些细胞因子可能参与增殖、免疫调节、细胞凋亡和血管生成过程,并可以通过静脉移植、原位注射或腹腔注射h AECs或h AECs条件培养基改善卵巢功能,但其具体机制仍不十分清楚。第一部分 hAECs的原代细胞提取及生物学特性目的提取h AECs并培养、鉴定,为后续实验提供细胞移植的种子细胞。方法征得孕妇及家属同意并书面签署知情同意书后,收集经剖腹产分娩的羊膜组织,采用胰酶消化法获取h AECs;通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物的表达,对分离培养的h AECs进行鉴定;通过细胞免疫荧光检测h AECs表达卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)的情况。结果分离纯化的h AECs呈铺路石样,细胞大小及形态均一,呈圆形或多角形,并呈集落样生长;4代后细胞渐呈梭形,细胞增殖减慢;h AECs高表达干细胞标志物(SSEA4,Nanog)、上皮细胞标志物(CD324,CD326);而低表达间充质细胞标志物(CD105)、造血干细胞标志物(CD34、CD45)和免疫学标志物(HLA-DR);h AECs可以表达颗粒细胞的标志物FSHR。结论h AECs来源丰富,具有干细胞及上皮细胞特性,低免疫原性,无成瘤性,在干细胞治疗领域中具有广阔的应用前景。第二部分 环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤模型的建立目的建立稳定的环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的动物模型。方法将8-10周龄有规律动情周期的SD大鼠随机分为4组(环磷酰胺注射第1天记为D1):对照组(D1-D15 0.9%生理盐水);低剂量环磷酰胺损伤组(D1 50mg/kg,D2-D15 8mg/kg);中剂量环磷酰胺损伤组(D1 100mg/kg,D2-D15 8mg/kg);高剂量环磷酰胺损伤组(D1200mg/kg,D2-D15 8mg/kg)。(1)观察大鼠一般状态,称量体重及卵巢重量,绘制大鼠的生存曲线;(2)检测大鼠的动情周期改变,分析环磷酰胺对大鼠卵巢的毒性作用;(3)化学发光法检测化疗结束后3天及2周的血清雌激素E2水平,了解环磷酰胺对大鼠内分泌功能的作用;(4)Elisa检测化疗结束后2周的血清AMH及FSH水平,了解环磷酰胺对大鼠内分泌功能的作用;(5)HE染色观察大鼠卵巢组织学改变及卵泡计数,评估环磷酰胺对卵巢组织学的损伤情况及对卵泡的作用。结果(1)低剂量环磷酰胺组大鼠体重及卵巢重量降低,死亡率低,中、高剂量环磷酰胺组大鼠死亡率高,故选用低剂量环磷酰胺构造卵巢功能不全的模型;(2)模型组大鼠的血清雌激素E2水平较对照组在化疗结束后3天有所下降,在化疗结束后2周明显下降;(3)模型组大鼠的血清AMH较对照组在化疗结束后2周明显下降,而FSH水平较对照组在化疗结束后2周明显上升;(4)模型组及对照组大鼠在化疗开始前均有规律的动情周期,化疗开始后1周,模型组约54%的大鼠出现异常的动情周期,化疗结束后1周模型组仍有46%的大鼠表现为异常的动情周期,而此过程对照组大鼠均有正常的动情周期;(5)环磷酰胺给药后卵巢组织损伤明显,卵巢纤维化明显,模型组较对照组窦前卵泡、窦卵泡明显减少,而闭锁卵泡显著增加。结论低剂量环磷酰胺经腹腔注射(D1 50mg/kg,D2-D15 8mg/kg),可以建立稳定的环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的模型。第三部分 hAECs修复大鼠卵巢卵巢功能不全的有效性研究目的探究h AECs修复环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的有效性及对生育力的影响,并初步探究h AECs治疗的机制。方法选用PHK26荧光染料成功标记第1代h AECs,用于h AECs移植的体内追踪。将8-10周龄的SD大鼠纳入实验,将大鼠随机分为4组,以第1次腹腔注射环磷酰胺或生理盐水记为第1天(D1)。对照组(D1-15腹腔注射0.9%生理盐水,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射PBS);模型组(D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射PBS);h AECs经尾静脉移植组(D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射h AECs,双卵巢原位注射PBS);h AECs经卵巢原位移植组(D1-15腹腔注射环磷酰胺,D16尾静脉注射PBS,双卵巢原位注射h AECs)。(1)实验中观察大鼠一般状态,称取大鼠体重及卵巢重量;(2)卵巢组织冰冻切片后观察细胞移植后24小时及2周后PKH26标记的h AECs在卵巢中的存活与分布情况;(3)Elisa检测血清中AMH及FSH水平,分析h AECs移植对大鼠内分泌功能的影响;(4)阴道涂片检测大鼠动情周期改变,了解h AECs移植对下丘脑-垂体-性腺轴的完整性的作用;(5)HE染色观察卵巢组织学改变及卵泡计数,评估h AECs修复大鼠卵巢组织结构的效果;(6)免疫组化检测AMH、FSHR及Klotho蛋白在卵巢的分布及表达情况,初步探究h AECs移植修复卵巢损伤可能的机制;(7)大鼠合笼实验探究并记录大鼠胚胎的数量,评估h AECs移植对大鼠生育力的作用。结果(1)PKH26标记的h AECs可以向损伤的卵巢迁移,在细胞移植后24小时、2周均可以观察到红色荧光,移植的h AECs主要分布于卵巢间质区;(2)h AECs移植后可以在一定程度上提高损伤大鼠的体重及卵巢重量;(3)与模型组相比,h AECs移植可以升高损伤大鼠血清AMH水平,并降低血清FSH水平,改善卵巢功能不全大鼠的内分泌功能;(4)h AECs移植可降低损伤大鼠的异常动情周期,降低环磷酰胺所致的卵巢毒性作用;(5)h AECs移植使窦前卵泡、窦卵泡数量增加,闭锁卵泡数量减少,对卵巢组织有修复作用;(6)与模型组相比,h AECs移植可使卵巢组织AMH、FSHR及Klotho蛋白的表达水平上调;(7)h AECs尾静脉移植组、h AECs原位注射组及模型组大鼠的胚胎数量较对照组显著减少,尾静脉移植细胞组大鼠合笼后胚胎数较模型组明显增加,原位注射细胞组大鼠的胚胎数量较模型组略有增加。结论h AECs移植可以修复损伤的卵巢功能和结构,增加窦前及窦卵泡的数量,减少闭锁卵泡的数量;h AECs静脉移植可以显著改善受损大鼠的生育力功能;h AECs移植可以使卵巢组织AMH、FSHR及Klotho蛋白的表达水平上调,可能与抑制原始卵泡过度激活、促进生长卵泡发育、成熟及调节颗粒细胞的功能有关。第四部分 hAECs修复大鼠卵巢功能不全的机制研究目的h AECs修复大鼠卵巢功能不全的可能机制,希望为化疗引起的卵巢损伤的治疗提供相关理论基础,为临床上修复损伤的卵巢功能提供新的思路和策略。方法在已经证实h AECs在修复环磷酰胺所致大鼠卵巢损伤的可行性后,本实验选用RNA SEQ进行三组卵巢组织的测序,每组含3例卵巢组织。三组分别为h AECs尾静脉移植组、h AECs原位注射组及模型组,在h AECs移植后2周取卵巢组织进行测序及进一步验证。(1)卵巢组织的总RNA提取、逆转录、合成双链c DNA、扩增及测序,生物信息学分析h AECs治疗组与模型组的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),对差异表达基因的GO(Gene Ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析,了解差异基因的功能及可能涉及的通路;(2)RT-q PCR验证部分差异表达基因,进一步明确差异基因的表达水平;(3)免疫组化及Western Blot验证显著富集的类固醇激素合成通路的蛋白表达水平,从基因及蛋白表达水平探究h AECs治疗的潜在机制。结果(1)m RNA测序发现h AECs尾静脉移植组和模型组共有783个表达差异的基因,其中有619个上调的差异基因及164个下调的差异基因。而原位注射h AECs组与模型组之间有168个差异表达基因,其中116个上调的差异基因和52个下调的差异基因;(2)GO分析显示,h AECs尾静脉移植组与模型组的DEGs主要富集于离子通道活性和跨膜转运蛋白活性,而原位注射h AECs组与模型组的DEGs显著富集类固醇激素生物合成过程和类固醇激素代谢过程。KEGG分析显示,h AECs尾静脉移植组与模型组的DEGs在核糖体、蛋白消化和吸收通路、神经活动配体-受体相互作用通路及c AMP信号通路显著富集;而原位注射h AECs组与模型组的DEGs主要参与类固醇激素生物合成通路;(3)绘制维恩图发现尾静脉注射细胞组与原位注射细胞组相对于模型组共同差异表达的基因共有4个,包括2个上调和2个下调的基因。在进一步的q PCR验证中,2个上调差异基因IRF7(regulatory factor 7)与Mx1(Mx dynamin-like GTPase 1)表达与测序结果一致,即IRF7与Mx1在尾静脉注射细胞组与原位注射细胞组的表达均显著增加,相对于模型组卵巢组织的表达。而另两个下调差异基因MFAP31(microfibril-associated glycoprotein 3-like)及CITED2(c AMP-responsive element-binding protein(CREBBP)/p300-interactingtrans-activator 2 with glutamic acid(E)and aspartic acid(D)-rich tai)在q PCR的验证中,三组无显著差异;(4)KEGG分析显示原位注射组与模型组间DEGs主要富集于类固醇激素生物合成通路,进一步q PCR发现,Msmo1、SQLE、NSDH1、FDFT1、TM7SF2在原位注射组显著上调,而其他三个基因DHCR24,CYP51,HSD17B7仍然高于模型组,这与测序结果比较一致;m RNA测序结果显示,与模型组相比,原位注射h AECs组中与合成雌激素和黄体酮的关键酶如Star、Cyp11a1、Cyp19a1和Hsd17b1的表达值(FPKM值)也升高。此外,我们还观察分析了3组中血管内皮生长因子受体1(Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)、VEGFR2和VEGFR3的表达。VEGFR1(原位注射h AECs组)和VEGFR2(静脉移植h AECs组)的表达分别较模型组显著升高(P<0.05),而VEGFR3在3组间无差异;(5)免疫组化和western blotting分析发现,原位注射细胞组与模型组之间DEGs显著富集的类固醇激素生物合成通路的其中2个酶角鲨烯单加氧酶(Squalene monooxygenase,SQLE)和法尼基二磷酸法尼基转移酶1(Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1)主要在卵巢黄体组织的颗粒细胞中表达,原位注射组的表达较模型组显著升高(P<0.01)。结论h AECs移植可能通过上调AMH表达,减少原始卵泡的过度激活;增加FSHR及KL蛋白表达,维持生长卵泡的发育及促进卵泡成熟;高通量测序结果显示h AECs移植对核糖体、蛋白消化、蛋白吸收、神经活性配体-受体相互作用、c AMP信号通路、甾体生物合成通路等均有影响,促进类固醇激素合成、卵泡发育和排卵;此外,h AECs移植还可通过上调促血管及抗炎因子IRF7、Mx1、VEGFR1及VEGFR2,促进血管生成,减少炎症等发挥修复作用。