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犬问荆(Equisetum palustre L.),为木贼科(Equisetaceae)、问荆属(Equisetum)一种多年生蕨类植物。在民间,犬问荆被用于治疗前列腺炎、膀胱炎、消化性溃疡、痔疾、风湿症等炎症相关疾病,目前其活性成分与药理活性研究严重不足。本文首次以抗炎活性为导向,对犬问荆的化学成分进行系统的分离、纯化和结构鉴定,阐明其药效物质基础并探讨其初步作用机制;利用现代科学分析方法建立了简单、准确的犬问荆活性成分质量控制分析方法;创新性地形成高效、高收率、高纯度的抗炎黄酮苷元纯化工艺。本论文研究为犬问荆资源的利用提供了科学依据与基础和技术支持,为开发天然抗炎制剂提供基础。全文工作取得进展如下:1.利用大孔吸附树脂富集、正相和反相硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶色谱、半制备型高效液相等多种色谱方法,从犬问荆提取物的抗炎活性部位中分离得到了 16个单体成分,根据理化性质和波谱数据(IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR、X射线衍射等)鉴定了其中的14个单体成分:芫花素(1)、芹菜素(2)、木犀草素(3)、4-0-(对-香豆酰基)莽草酸(4)、犬问荆内酯(5)、槲皮苷(6)、异槲皮苷(7)、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷(8)、山奈酚-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷(10)、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖-7-O-β-D-葡萄糖苷(11)、芹菜素-6,8-C-二-β-D-葡萄糖苷(12)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(13)、芦丁(14)、芹菜素-5-O-β-D-葡萄糖苷(15)。其中,化合物5为未见文献报道的新的倍半萜类化合物,命名为犬问荆内酯,此类化合物为木贼科植物首次发现。化合物1-4、6-8和12-15等11个化合物均为首次从犬问荆中分离得到。另外2个单体化合物(9和16)的结构正在鉴定中。2.以一氧化氮(NO)为指标,筛选纯化化合物的抗炎活性,实验结果发现,3个黄酮苷元芫花素(1)、芹菜素(2)、木犀草素(3)和2个黄酮糖苷山奈酚-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷(10)和木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(13)具有较强的体外抗炎活性。3.建立了同时分离检测犬问荆中13种活性成分的HPLC质量控制分析方法色谱条件:色谱柱:Luna C18(5 μm,250 mm × 4.6 mm i.d.);流动相由0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)组成;梯度洗脱条件:0-4 min,23%B;4-35 min,23-35%B;35-47 min,35%B;47-68 min,35-45%B;68-80 min,45-65%B;80-81 min,65-76%B;81-90 min,76-90%B;检测波长:4-O-(对-香豆酰基)莽草酸为310 nm,其他分析物为340 nm;流速:1.0 mL/min;进样体积:5μL;柱温:25℃。在上述条件下,对犬问荆中活性成分进行了分析,首次实现了13种活性成分的分离、定量。本方法灵敏度高、精密度良好,适用于犬问荆中活性成分的质量控制分析,为犬问荆化学成分的进一步研究提供科学基础,对犬问荆资源的开发和利用具有重要意义。4.比较并探讨了 3种黄酮苷元的炎症抑制作用和初步机制研究证实木犀草素、芹菜素和芫花素均呈浓度依赖性抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6,其中,木犀草素和芹菜素的抑制作用更为突出。对3种黄酮苷元抗炎机制的进一步探讨证实与其下调LPS诱导的RAW264.7细胞p38蛋白磷酸化水平有关。5.利用凝胶树脂快速色谱结合大孔吸附树脂建立了高效、高收率、高纯度的犬问荆抗炎黄酮苷元的纯化工艺(1)确定了大孔吸附树脂富集分离木犀草素、芹菜素和芫花素的工艺:树脂类型:D101型;上样浓度:木犀草素为0.1999 mg/mL,芹菜素为0.0835 mg/mL,芫花素为0.0482 mg/mL;上样体积:3 BV;上样流速:1 BV/h;解吸溶液及体积:7/3 BV 40%乙醇和4 BV 90%乙醇;解吸流速:3 BV/h。在上述最佳条件下,经一次大孔吸附树脂处理后,犬问荆提取物中木犀草素、芹菜素和芫花素的含量分别提高13.3倍、12.5倍和12.9倍,回收率分别为83.6%、78.8%和81.2%。(2)确定了 Toyopearl HW-40S凝胶树脂快速色谱分离纯化树脂富集产物中木犀草素、芹菜素和芫花素的工艺条件:洗脱流程:0-20 min,80%甲醇;20-40 min,92%甲醇;40-55 min,纯甲醇;55-70 min,甲醇/丙酮(3:1,v/v);70-80 min,纯丙酮;洗脱流速:30 mL/min;上样体积:3/40 BV。在上述最佳条件下,经过一次快速色谱分离纯化和重结晶后,木犀草素、芹菜素和芫花素的纯度均达到97%以上,收率均大于90%。该工艺具有溶剂可回收重复利用、产品纯度和收率高、易于规模化放大的特点。与以传统分离介质硅胶为固定相的快速色谱相比,Toyopearl HW-40S凝胶树脂快速色谱更适用于犬问荆中木犀草素、芹菜素和芫花素的快速分离纯化。