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1,3-1,4-β-葡聚糖酶,以下简称β-葡聚糖酶,是一种重要的工业用酶。β-葡聚糖酶通过专一性切割1,4-β-糖苷键可以有效降解禾本科植物细胞壁中的高分子量β-葡聚糖。在啤酒酿造行业中,外源添加β-葡聚糖酶可以有效加快麦汁过滤速度,提高麦汁浸出率和成品啤酒的非生物稳定性。在饲料行业中,添加外源β-葡聚糖酶可以消除β-葡聚糖的“抗营养因子”效应从而提高禽畜对麦类饲料的吸收效率,同时维护禽畜的肠道健康。然而目前β-葡聚糖酶依然存在热稳定性差、催化效率低等问题,其在麦芽制备、麦汁糖化和颗粒饲料制备过程中完全失活。因此,提高β-葡聚糖酶的热稳定性具有重要工业应用价值。本论文通过表面赖氨酸改造、二硫键引入和突变热点区域分析法等理性/半理性手段成功提高了芽孢杆菌来源β-葡聚糖酶的热稳定性并在枯草芽孢杆菌WB600中实现表达,最后将高热稳定性β-葡聚糖酶在麦汁协定糖化过程中进行应用。主要结论如下:(1)对芽孢杆菌来源β-葡聚糖酶表面赖氨酸在其热稳定性中作用进行分析。首先采用亚硝酸对β-葡聚糖酶表面赖氨酸进行化学修饰,发现赖氨酸ε-氨基基团的修饰有效提高了酶热稳定性。和野生酶相比,修饰酶的T50值提高了2.5℃,在50℃和60℃的半衰期分别提高了56%和76.8%。基于化学修饰研究,将特基拉芽孢杆菌来源β-葡聚糖酶表面赖氨酸选择性突变为丝氨酸。以蛋白质总能量值、氢键数量和比活力值为标准对热稳定性有利突变进行筛选,发现突变酶K20S、K117S和K165S的热稳定性优于野生酶。经过组合突变,组合突变酶K20S/K117S/K165S的最适温度和T50值和野生酶相比分别提高了15℃和14℃,而其在50℃和60℃的半衰期分别延长了170.9%和81.5%。与此同时,组合突变酶的催化性质优于野生酶。蛋白质结构分析发现在组合突变酶中形成了更多有序二级结构及更多氢键,这可能是赖氨酸突变后β-葡聚糖酶热稳定性提高的原因。(2)采用基于蛋白质结构分析及柔性分析的三步筛选法对β-葡聚糖酶热稳定性有利二硫键引入位点进行筛选。根据筛选结果,在β-葡聚糖酶中引入二硫键N31C-T187C和P102C-N125C可以降低β-葡聚糖酶整体/区域柔性且不影响酶催化性质。结果显示,引入二硫键后突变酶N31C-T187C和P102C-N125C的溶解温度和野生酶相比分别提高1.4℃和2.3℃。组合突变酶N31C-T187C/P102C-N125C的溶解温度和野生酶相比提高了4.1℃,而其在60℃的半衰期也明显延长。组合突变酶的催化性质并没有改变,而其最适p H值从p H6.5降至p H6.0。蛋白质结构分析显示预期二硫键的引入及突变区域内新氢键的形成可能是组合突变酶热稳定性提升的原因。(3)采用基于同源蛋白质氨基酸序列比对、结构空间区域化和分子动力学模拟的突变热点区域分析法对微生物来源β-葡聚糖酶热稳定性关键位点进行预测。结果显示,β-葡聚糖酶中钙离子结合区域和酶热稳定性有较高相关性。将钙离子结合区域中6个非保守氨基酸残基进行改造,发现40位、43位、46位和205位氨基酸的突变有效提高了β-葡聚糖酶的热稳定性。采用迭代饱和突变法对该四个位点进行突变,得到突变酶E46P/S43E/H205P/S40E的最适温度、T50值和溶解温度和野生酶相比分别提高了20℃、14.5℃和13.8℃。突变酶在60℃和70℃的半衰期是野生酶的3.86倍和7.13倍。蛋白质结构分析显示突变酶的钙离子结合区域带有更多负电荷,其与钙离子结合更为紧密。与此同时,突变酶整体结构有序性和野生酶相比有大幅度提高,这可能是突变酶热稳定性提升的原因。(4)将理性/非理性方法得到的β-葡聚糖酶热稳定性有利突变进行组合突变,并在枯草芽孢杆菌WB600中实现表达。组合突变酶的最适温度、T50值和溶解温度为70℃、81.7℃和56.2℃,和野生酶相比分别提高了25℃、19.7℃和15.9℃。组合突变酶在60℃和70℃的半衰期达到153.2 min和99.6 min,分别是野生酶的4.71倍和9.05倍。组合突变酶的最适p H值和野生酶相比降低了0.5个p H,而其在酸性环境下的稳定性也有大幅度提高。与此同时,组合突变酶的比活力值和kcat值和野生酶相比分别提高72.4%和37.5%。重组枯草芽孢杆菌经过发酵条件优化后分泌β-葡聚糖酶最高酶活达到4840.4U·m L-1,是野生酶酶活和重组大肠杆菌发酵酶活的3.31倍和2.03倍。将组合突变酶添在麦汁协定糖化过程中进行应用,发现其能将麦汁过滤时间和麦汁黏度分别降低29.7%和12.3%,效果优于两种市售酶。