论文部分内容阅读
目的：艾拉莫德(iguratimod，T-614)是用于治疗成人活动性类风湿关节炎的1类新药。前期功能研究提示它能抑制IFN-γ、IL-1、IL-6、TNF-a等细胞因子，免疫球蛋白(IgM、IgG)的产生并选择性抑制COX-2，可能通过NF-κB信号通路抑制和降低炎症反应。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）能启动初始免疫应答、诱导免疫耐受，是治疗自身免疫性疾病的重要突破口。国内外暂未见艾拉莫德对DCs的功能的研究。本实验旨在探讨艾拉莫德对健康人外周血DCs的分化和成熟的影响。方法：本课题采用密度梯度离心法（区带离心法）和贴壁法建立人类外周血单核细胞分化的DCs体外培养体系，采用噻唑蓝比色（MTT）法检测艾拉莫德不同浓度作用后对树突状细胞的存活率的影响，流式细胞术测定艾拉莫德作用后树突状细胞表面分子的表达。应用混合淋巴细胞反应（MLR）的方法检测受艾拉莫德作用后的树突状细胞对淋巴细胞的刺激增殖能力。进一步检测艾拉莫德对DCs分泌细胞因子IL-12的影响，验证艾拉莫德对DCs功能的作用。结果：1.倒置相差显微镜下观察树突状细胞的形态，iDCs大部分贴壁，表面突起较少细胞多呈现较小的圆形，可见大部分的细胞聚集贴壁。脂多糖刺激24h后再观察，细胞体积增大呈圆形或椭圆形，表面可见许多不规则树突状突起,大部分悬浮为典型的mDC形态。经流式细胞学检测，iDCs表面低表达CD86和CD83， CD86阳性数占10.7%、CD83占17.2%，而高表达HLA-DR和CD80，HLA-DR阳性数占89.8%、CD8092.1%，经LPS刺激24h后，iDCs向mDC发展，CD86阳性数占为78.7%、CD83占84.7%，较未成熟细胞的阳性细胞数明显增高。2.不同浓度艾拉莫德（50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/、250ug/ml）作用于DCs细胞，经MTT法检测DCs的存活率>80%。随着艾拉莫德浓度的增加作用于DCs，观察其形态与正常对照组相比，体积变小更圆，贴壁细胞增多，表面的树突较少，表明实验浓度作用下树突状细胞呈非成熟状态。艾拉莫德的浓度在200ug/ml、250ug/ml时作用于iDCs≥3h，再予LPS刺激细胞成熟，流式细胞仪检测树突状细胞表面分子，CD86阳性数占19.3%与16.0%，较正常成熟细胞的阳性数明显下降。与其他浓度组CD86的阳性数有显著性差异，与其他表面分子的阳性数也有显著性差异。3.艾拉莫德浓度为50ug/ml作用于树突状细胞，3h后LPS刺激细胞成熟，再与同种异体淋巴细胞1：1混合培养，其OD值最大为0.6536。同种试验方法，各个浓度组间、比例组间分别有极显著差异（p<0.01）。不同浓度艾拉莫德作用于DCs后，在浓度为250ug/ml时树突状细胞分泌IL-12的表达量最低，为5.7pg/ml，在浓度为50ug/ml时最高，为222.3pg/ml。结论：1.艾拉莫德能够剂量依赖性的改变人类单核细胞来源的树突状细胞的形态。2.艾拉莫德浓度为200ug/ml及250ug/ml时作用于树突状细胞的时间≥3h，树突状细胞表面受体CD86的表达明显下降，艾拉莫德对DCs表达CD86抑制作用。3.树突状细胞与同种异体淋巴细胞混合培养，淋巴细胞的增殖能力与艾拉莫德的浓度相关。4.艾拉莫德可呈剂量依赖性的抑制树突状细胞分泌IL-12。