第一部分 IDE与胰岛素抵抗和糖尿病MCI的相关性研究背景:胰岛素降解酶(IDE)可降解胰岛素和β-淀粉样蛋白(Aβ),与2型糖尿病慢性并发症及(AD)的发生发展有密切的关系。胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病的始发因素之一,既往研究表明IR会增加认知功能障碍甚至AD的发生风险,也是糖尿病轻度认知障碍(MCI)向AD转化的危险因素。目的:研究IDE与胰岛素抵抗、2型糖尿病MCI的相关关系,探讨IDE对2型糖尿病MCI发生的预测价值。方法:本研究共招募239位2型糖尿病患者,根据MoCA得分将其分为MCI组和认知功能正常组。所有受试者入组后于次日早晨7点空腹抽取静脉血,测定空腹血糖、空腹C肽、糖化血红蛋白、肝肾功能、血脂全套,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。用多维度量表评估受试者的认知功能,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法检测IDE rs4646958基因多态性,并用酶联免疫吸附法测定血清IDE浓度。结果:纳入的2型糖尿病患者中,132人符合MCI的诊断标准,107人是与之相匹配的认知功能正常组。结果表明:1、与认知功能正常组比较,2型糖尿病MCI组患者的血清IDE显著降低(P<0.001),HOMA-IR显著升高(P<0.001); 2、在2型糖尿病MCI患者中,血清IDE水平和MoCA得分呈显著正相关(r = 0.827;P<0.001 ),HOMA-IR和MoCA得分呈显著负相关(r = -0.644;P<0.001); 3、在所有2型糖尿病患者中做的相关分析表明,血清 IDE 水平和 MoCA 得分(r = 0.798;P< 0.001)呈正相关,和 HOMA-IR (r =-0.586;P <0.001 )、连线试验 A (r =-0.464;P <0.001 )、连线试验 B (r = -0.399;P <0.001)、空腹血糖(r = -0.409;P<0.001)、糖化血红蛋白(r = -0.237;P= 0.015)及平均血糖波动幅度(r =-0.502;P< 0.001)呈负相关;4、回归分析显示,调整了年龄、性别、受教育年限、肝肾功能和血脂水平后,IDE(P=0.001)、糖化血红蛋白(P=0.024)、空腹C肽(P<0.001)是2型糖尿病发生MCI的影响因素;5、IDE rs4646958基因型在2型糖尿病认知障碍组及认知功能正常组均未发现统计学差异。结论:IDE参与胰岛素抵抗相关的2型糖尿病早期认知功能障碍(特别是执行功能),可能成为早期的预测指标。IDE rs4646958基因多态性在2型糖尿病认知障碍中并未发现显著统计学结果,需要大规模样本进一步明确其在易感人群中的预测价值。第二部分 IDE参与KKAy小鼠认知功能障碍的机制及PPARy激动剂的干预效应背景:胰岛素抵抗是2型糖尿病的最显著的临床病理特征,早于显著的2型糖尿病症状发生,参与了糖尿病早期认知障碍的发生以及向AD的转化。过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPARγ)的表达和胰岛素的敏感性呈正相关,它可以通过调节胰岛素信号通路,调控IDE的表达。PPARy激动剂可改善胰岛素抵,减少认知功能障碍和AD的发生。我们前期的研究发现2型糖尿病MCI的患者中,血清IDE水平较低,和胰岛素抵抗介导的认知功能下降显著相关,可能是2型糖尿病发生认知障碍的预测指标。在临床研究的基础上,我们进一步通过动物实验来证实IDE参与胰岛素抵抗相关的认知障碍机制和PPARy激动剂的预防和干预效应。目的:从动物水平上探讨IDE保护动物认知功能的可能机制及其与Aβ水平的相关性,以及PPARγ激动剂在胰岛素抵抗介导的2型糖尿病小鼠认知功能损伤的预防和治疗效果。方法:本研究采用高脂喂养KKAy小鼠作为2型糖尿病轻度认知功能障碍模型,罗格列酮作为PPARy激动剂对小鼠进行预防和干预。选取6周龄清洁级健康雄性KKAy小鼠和其对应的C57BL/6j (C57)小鼠(均购于中国医学科学院实验动物所),适应性喂养一周。其中随机选出三组KKAy小鼠在8周龄时分别给予低、中、高剂量罗格列酮预防,其他三组在小鼠15周龄出现认知障碍时给予罗格列酮低、中、高剂量干预,还有一组作为2型糖尿病未干预的对照组。将罗格列酮溶于0.9%生理盐水中配置成所需浓度的混悬液,低剂量组每天予1mg/ (kg·d)灌胃,中剂量组每天予3.3mg/ (kg d)灌胃,高剂量组每天予10mg/ (kg· d)灌胃,糖尿病对照组及正常组C57小鼠予等剂量生理盐水灌胃3个月。处理后进行以下检测:1、每周监测小鼠体质量、空腹血糖及空腹胰岛素水平,计算出相关的胰岛素抵抗指数;2、通过水迷宫及避暗实验观察小鼠的行为学变化;3、Western及RT-PCR法测定小鼠海马PPARγ、IDE的mRNA及蛋白水平;4、对脑组织切片进行HE染色、尼氏染色,镜下观察各组小鼠大脑组织神经元形态、尼氏体的改变;5、免疫化学法测定小鼠脑组织PPARγ、IDE、Aβ的表达。结果:1、各组小鼠体质量、空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数水平的比较:各周龄KKAy小鼠的体质量、空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗水平均高于对照组C57小鼠(P< 0.05),和模型对照组相比,罗格列酮预防和干预组的体质量均无显著统计学差异(P>0.05),空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗水平显著下降(P<0.05),高剂量效果更为显著。2、各组小鼠行为学比较:水迷宫实验结果表明,与正常对照组相比,模型对照组小鼠逃避潜伏期显著延长,穿台次数显著减少(P<0.05);与模型对照组小鼠相比,罗格列酮干预和预防组小鼠逃避潜伏期显著减少,穿台次数显著延长(P<0.05)。避暗实验结果表明,和正常对照组小鼠相比,模型组小鼠避暗潜伏期显著缩短,错误次数显著增加(P<0.05),罗格列酮低预防和干预后,潜伏期和错误次数均有显著改善(P<0.05),高剂量的效果尤其显著。3、海马组织PPARγ及IDE的mRNA及蛋白水平:模型对照组小鼠海马内PPARy及IDE的mRNA及蛋白水平显著下降(P<0.05),经罗格列酮预防和干预后PPARy及IDE的mRNA及蛋白水平均显著增加(P< 0.05),高剂量的效果尤其显著。4、各组小鼠神经元形态的改变:HE染色:正常对照组小鼠海马组织中,神经元细胞形态结构未见显著异常,细胞核形状呈圆形,细胞结构层次清楚且排列整齐。模型对照组小鼠海马组织的部分细胞出现形态结构的破坏,细胞核皱缩,边缘模糊,细胞结构排列松散,有变形甚至坏死。罗格列酮预防和干预后,小鼠海马组织的细胞形态结构的破坏程度有所减轻,排列松散情况好转,神经元的变性坏死程度减轻,病理损伤有所好转。尼氏染色:正常对照组小鼠海马神经元未见显著异常,胞核膜和核仁较清楚;模型对照组小鼠的海马、额叶皮质的细胞排列疏散、细胞间隙较宽,胞浆内Nissl体较少。罗格列酮预防和干预组小鼠与模型组小鼠比较,组织结构有所改善,神经元细胞排列密集、整齐,胞浆中Nissl体增加。5、免疫化学法测定小鼠脑组织PPARγ、IDE、Aβ的表达:正常组小鼠海马组织细胞排列紧密,胞体小,Aβ蛋白着色较浅,表达较弱。模型对照组小鼠海马组织细胞排列疏松,胞体较大,Aβ着色深,表达呈强阳性,PpAaγ及IDE的IOD值显著减少(P<0.05)。罗格列酮预防和干预组小鼠PPARy及IDE的IOD值显著增加,Aβ蛋白显著减少(P<0.05)。结论:IDE参与胰岛素抵抗所致的糖尿病早期认知障碍,对认知功能起到保护作用。PPARγ激动剂可能是通过升高IDE和降低Aβ水平来预防和改善KKAy小鼠的认知功能障碍的。第三部分 IDE介导的PPARy激动剂对PC12细胞APP和Aβ的影响背景:前期实验证实PPARγ激动剂可能是通过升高IDE和降低Aβ水平来预防和改善KKAy小鼠的认知功能障碍的。但在细胞水平,PPARy激动剂对神经细胞的保护作用机制尚未明确。目的:研究IDE介导的PPARγ激动剂对PC12细胞淀粉样前体蛋白(APP)和Aβ的影响,探讨PPARy激动剂神经保护作用可能的潜在机制。方法:选取未分化的PC12细胞株,以神经生长因子诱导为神经元细胞。预试验采用1Oμmol/L的罗格列酮、20μmol/L的氯喹、12.5μmol/L的T0070907分别处理后,处理组和对照组相比具有显著的统计学差异,后续的实验就用该浓度作为理想浓度来处理PC12细胞。在细胞稳定生长24小时后随机分为六组:正常对照组、罗格列酮干预组、T0070907处理组、T0070907预处理+罗格列酮组、氯喹处理组、氯喹预处理+罗格列酮组,每个组设6个平行复孔。干预处理后收集各组相应时间点的细胞,用RT-PCR以及Western blotting分别检测PPARγ、IDE、APP等指标mRNA和蛋白的表达水平;用ELISA法检测细胞培养液上清液Aβ水平。结果:结果显示:1、和正常对照组相比,罗格列酮干预组的PPARy和IDE的mRNA和蛋白含量显著增加(P< 0.05),APP的mRNA和蛋白含量显著减少(P<0.05); 2、单独用T0070907处理组和用T0070907与罗格列酮联合处理组相比,PPARγ、IDE和APP的mRNA和蛋白含量未见显著统计学差异(P>0.05); 3、和氯喹处理组相比,用氯喹与罗格列酮联合处理组PPARy的mRNA和蛋白含量显著升高,IDE和APP的mRNA和蛋白含量未见显著统计学差异(P> 0.05); 4、和正常对照组相比,罗格列酮干预组的PPARy和IDE的培养液上清液的Aβ含量显著减少(P<0.05),其他各组培养液上清液的Aβ含量未见显著统计学差异(P>0.05)。结论:PPARy激动剂可诱导DDE的表达,从而促进APP和Aβ的降解。但是,PPARy激动剂对IDE诱导的神经细胞损伤的保护作用,均可被PPARy抑制剂T0070907及IDE抑制剂氯喹所拮抗,表明PPARγ激动剂的神经细胞损伤的保护机制是通过PPARy激活IDE途径参与调节的。