肌肉功能的恢复与肌肉的再生密切相关。但是，肌细胞再生能力很弱，已发育成熟的骨骼肌一般不具有再生能力，断端不能直接连接，而通过肉芽组织形成，疤痕修复。自肌卫星细胞发现以来，已经通过肌卫星细胞移植的方法修复心肌坏死组织，骨骼肌发育成熟以后，本身的卫星细胞均处于静止状态，数量又少，不能满足再生要求，肌母细胞和胚胎干细胞虽然具有可诱导分化能力，但数量少。寻找新的成肌来源成为亟待解决的问题。 随着对肌肉功能的研究不断深入，逐步从早期的组织移植深入到肌肉发生、分化及分子调控领域。近年来研究发现，肌肉再生能力是由各种肌肉转录因子调控的，其中MyoD起重要的作用。基因治疗作为前景广阔的治疗方法正在迅速发展；组织工程更是开辟组织修复的崭新一页。目前，人们已经能够采用基因治疗方法为组织工程提供所需的种子细胞。 本文研究目的：通过基因转染的方法，使已定向分化的成纤维母细胞异位表达MyoD，观察其向肌细胞转化的现象；寻找一种新的方法：利用损伤的肌肉组织在修复过程中早期肉芽组织的大量成纤维母细胞，通过基因调控，将其转化为肌细胞；利用转染后的成纤维母细胞，通过组织工程方法研究肌肉组织体外培养和增殖；将转基因的成纤维母细胞移植入动物体内，观察其生肌修复作用，以期避免疤痕形成，改善肌肉功能。 一、鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体的构建 通过分子生物学方法将含MyoD cDNA的质粒PEMMBC2β5于大肠杆菌E.Coli DH5a内扩增；提取及纯化PEMMBC2β5质粒；经DNA序列分析含MyoD cDNA；限制性酶切MyoD cDNA片段，连接到真核表达质粒pcDNA3-neo内，克隆出真核表达载体pcDNA3／MyoD，并成功进行 窜四二区大学俗士论又 了鉴定。成功构建肌肉转录调节因子MyOD基因真核表达载体，为深人研 究MyOD在肌肉修复中的分子调节机制，刷起在肌肉损伤方面的生物学 行为及临床应用提供物质基础。 二、鼠 MyOD ODNA对小鼠成纤绷细胞N’－－3T3的转染、鉴定及克 隆筛选 进行 G4药物毒性实验，确定 G4筛选浓度为 600。gjmL；采用 脂质体包埋 MyOD CDNA的真核表达质粒pCDNA3／MyOD转染培养的 Nffi 3T3细胞，经 G4筛选、克隆、扩大培养；对 MyOD转染的 NIH 3T3细 胞进行PCR鉴定，观察是否已将外源性的鼠生肌调节因子MyOD基因成 功导人 NIH 3T3细胞。结果证实 pCDNA3／MyOD可经脂质体介导有效地转 人靶细胞Nm 3T3细胞内；用G418筛选纯化转基因后的Nm 3T3细胞 DNA中可检测到MyoD基因。 三、鼠 MyOD CDNA对小舰纤维母细胞 N’－－3T3转染的生物学作用 对携带 MyOD CDNA的成纤维母细胞生物学行为进行分析，了解其生 物学行为的转变，是本文研究的核心。通过RT－PCR，点杂交等分子生物 学手段确定了MyOD得到了正确的转录和表达；借助于免疫组化、激光共 聚焦昂微镜1见察等手段对MvoD的下游分子myogenh和m吓1onkavy chains，即肌肉特异性蛋白进行了检测，证实MyoD在转染细胞克隆内表 达，并促进了一系列肌特异性基因的表达，表明已经向肌细胞转化。 四．携带小鼠MyoD基因的NIH3T3细胞的体外培养特性观察 通过体外培养携带小鼠MyOD基因的3T3细胞，观察其不同于成纤 维母细胞的生物学特性。经分化培养基诱导，培养1周后，实验组出现了 多细胞融合现象，有肌管形成。透射电镜观察，可见Z带样结构，肌丝， 细胞融合。可见异位表达MyOD基因可以改变成纤维母细胞的生物学特 性，转向分化为肌细胞，并能体外形成多核肌管，形态学得以证实。 3 亨四军医大学谆士论又 五、MyoD在小鼠体内肌肉损伤修复性肉芽组织中的肌肉转化作用 本实验使用基因直接注入的方法，在动物模型体内成纤维母细胞中异 位表达MyOD，通过对成纤维母细胞分化潜能的转化作用，观察肌细胞形 成现象c实验表明在活体组织内，通过直接转染是可以将肉芽组织中的修 复性成纤维母细胞转变为成肌细胞的。 六、M｝，OD转染的小鼠NIH3T3细胞在裸鼠异位成肌功能的实验研究 通过细胞移植的方法，将＊，OD基因转染小鼠3T3细胞移植到裸鼠 皮下，观察移植细胞在体内的发育情况，为通过细胞移植修复受损肌肉探 索一条新的途径。