背景和目的:黄连解毒汤是我国中医药的传统方剂,研究表明其在抗炎、抗肿瘤、改善微循环等诸多方面具有药理作用。然而目前对于黄连解毒汤在骨关节炎治疗方面的疗效以及作用机制尚不明确。本研究通过网络药理学分析黄连解毒汤治疗骨关节炎的活性成分及靶点,利用高效液相色谱技术对复方中的活性成分进行验证,并通过过氧化氢诱导人正常软骨细胞系（C28/I2）构建骨关节炎体外细胞模型,结合细胞生物学和代谢组学对黄连解毒汤中活性成分的保护作用及作用机制进行深入研究,以期为黄连解毒汤治疗骨关节炎的基础研究与临床应用提供依据与思路。方法:1.黄连解毒汤治疗骨关节炎的网络药理学研究:以口服生物利用度OB≥30%,类药性DL≥0.18为筛选标准,通过TCMSP数据库筛选黄连解毒汤的活性成分,利用TCMSP、Swiss Target Prediction和Pharm Mapper数据库筛选活性成分潜在作用靶点,使用OMIM、Drugbank和Genecards数据库检索骨关节炎疾病相关靶点基因,绘制成分-疾病共同靶点,使用String数据库构建蛋白互作网络,通过Metascape数据库进行GO分析和KEGG通路富集分析,使用Cytoscape3.8.2软件构建构建“黄连解毒汤-成分-靶点-骨关节炎”网络,预测其可能作用的靶点及分子机制。2.黄连解毒汤的化学物质基础研究:利用高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）技术,采用Wonda Sil C18 Superb 5μm色谱柱（250mm×4.6 mm,5μm）,以乙腈-0.4%磷酸水为流动相进行梯度洗脱,于254 nm和203 nm波长下,对黄连解毒汤的化学物质基础进行分析。3.体外细胞实验研究黄连解毒汤中活性成分对骨关节炎软骨细胞的保护作用:利用过氧化氢诱导损伤的人正常软骨细胞C28/I2构建骨关节炎体外细胞模型,通过细胞形态学观察、甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色进行鉴定,设正常对照组、模型组、黄连解毒汤不同活性成分给药组,以肝素（180 U）为阳性对照组,采用CCK-8实验检测黄连解毒汤中活性成分对骨关节炎软骨细胞增殖能力的影响;采用Annexin-V FITC/PI观察细胞凋亡情况;通过划痕实验检测活性成分给药后对细胞愈合能力的影响;采用RT-q PCR检测软骨细胞中SOX9、ACAN、COL2A1、COL10A1以及基质金属蛋白酶MMP3、MMP13 m RNA的表达情况;采用Western blot检测基质金属蛋白酶MMP3、MMP13以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况,探讨黄连解毒汤活性成分对骨关节细胞的保护作用。4.代谢组学研究黄连解毒汤中活性成分治疗骨关节炎的作用机制:采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（Ultra Performance Liquid ChromatographyTime of Flight Mass Spectrometry,UPLC/Q-TOF-MS）技术对黄连解毒汤活性成分与细胞共培养模型进行非靶向代谢组学研究,通过多元统计分析,采用正交偏最小二乘法-判别分析OPLS-DA结合各组分的贡献率（VIP>1,P<0.05）筛选差异代谢物,经数据库匹配对其进行鉴定,对比给药前后差异代谢物的变化,进行通路富集分析揭示黄连解毒汤治疗骨关节炎的潜在作用机制。结果:1.黄连解毒汤治疗骨关节炎的网络药理学研究:通过筛选获得了黄连解毒汤中的有效活性成分85种,潜在靶点747个,骨关节炎疾病靶点2037个,取两者交集获得共同靶点265个,核心靶点24个;构建“黄连解毒汤-成分-靶点-骨关节炎”网络,黄连解毒汤治疗骨关节炎主要活性成分的拓扑参数显示山奈酚、黄柏酮、槲皮素的Degree值比较靠前,提示山奈酚、黄柏酮、槲皮素等活性成分可能在骨关节疾病中起到治疗作用。2.黄连解毒汤的化学物质基础研究:HPLC结果显示黄连解毒汤中药提取物中存在山奈酚、黄柏酮、槲皮素三种有效活性成分。3.体外细胞实验研究黄连解毒汤中活性成分对骨关节炎软骨细胞的保护作用:通过细胞形态学观察、甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色鉴定培养的C28/I2细胞系为软骨细胞。CCK-8实验确定过氧化氢造模浓度与作用时间为1.2 m M/L、24 h,分别给予黄连解毒汤中的三种活性成分5μM山奈酚,3μM黄柏酮、30μM槲皮素作用24 h能够明显提高过氧化氢诱导损伤的骨关节炎软骨细胞增殖能力（P<0.05）。同时,Annexin-V FITC/PI检测细胞凋亡观察到5μM山奈酚,3μM黄柏酮、30μM槲皮素能够将总凋亡率从12.53%分别降低至10.96%、10.71%、7.89%,可以在不同程度上减轻过氧化氢诱导的软骨细胞凋亡。另外,细胞划痕实验表明,相较于模型组,5μM山奈酚,3μM黄柏酮、30μM槲皮素给药处理后细胞愈合能力提高。RT-q PCR结果显示,5μM山奈酚,3μM黄柏酮、30μM槲皮素可以明显提高氧化氢诱导的软骨细胞中的SOX9、COL2A1 m RNA的表达（P<0.05）,明显降低COL10A1、MMP3、MMP13 m RNA的表达（P<0.05）,也可提高ACAN m RNA的表达。Western blot实验结果显示,5μM山奈酚,3μM黄柏酮、30μM槲皮素给药后Bax蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,其中3μM黄柏酮、30μM槲皮素也可以有效降低MMP3蛋白的表达（P<0.05）。此外,5μM山奈酚,3μM黄柏酮、30μM槲皮素还可以降低MMP13蛋白的表达,尽管变化并不明显。4.代谢组学研究黄连解毒汤中活性成分治疗骨关节炎的作用机制:非靶向代谢组学筛选出正常软骨细胞、骨关节软骨细胞与山奈酚、黄柏酮、槲皮素三种活性成分给药后的差异代谢物共36种。对正常软骨细胞与骨关节炎软骨细胞的差异代谢物进行KEGG通路富集分析,得到甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、醚脂代谢、鞘脂代谢、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、氨酰-t RNA生物合成和嘌呤代谢等通路。其中山奈酚、黄柏酮、槲皮素三种活性成分差异代谢物富集通路涉及甘油磷脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及嘌呤代谢。结论:1.黄连解毒汤中的槲皮素、黄柏酮、山奈酚三种活性成分对于骨关节炎疾病具有一定的治疗作用。2.槲皮素、黄柏酮、山奈酚可以促进骨关节炎软骨细胞增殖、抑制凋亡、增强细胞的愈合能力,提高SOX9、ACAN、COL2A1、Bcl-2表达,降低COL10A1、MMP3、MMP13、Bax表达,对软骨细胞产生保护作用。3.骨关节炎发病机制涉及多种代谢通路,槲皮素、黄柏酮、山奈酚三种活性成分主要通过甘油磷脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及嘌呤代谢发挥作用。