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卡拉胶酶是一类能够断裂卡拉胶多糖链中的β-1,4糖苷键来降解卡拉胶的多糖水解酶,水解产物为具有多种生物活性的卡拉胶寡糖。本研究首先从食鹿角菜假交替单胞菌ASY5的发酵液的上清中分离纯化出κ-卡拉胶酶,通过蛋白质肽质量指纹图谱(PMF)法鉴定κ-卡拉胶酶,并用SWISS-MODEL同源模建分析其空间结构;其次,为分析不同来源的κ-卡拉胶酶的性质差异,对纯化的κ-卡拉胶酶进行了酶学性质测定;最后,以羧基功能化的Fe3O4纳米粒子为载体,戊二醛为交联剂,固定化κ-卡拉胶酶,对影响固定化酶活力及酶活回收率的因素进行优化,并分析固定化酶的理化性质及其降解产物。菌株ASY5的发酵液上清经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析及SuperdexTM 75 10/300 GL分子筛凝胶过滤层析分离出κ-卡拉胶酶,纯化产物在SDS-PAGE凝胶(银染)上显示单一条带,分子量为30 kDa,纯化酶的比活力达到2678.9U/mg,纯化倍数为10.9,酶活回收率为20.1%;κ-卡拉胶酶经PMF法鉴定为来自Pseudoalteromonas carrageenovora的κ-卡拉胶酶,SWISS-MODEL同源模建成功获得了目的蛋白κ-卡拉胶酶的三级结构。κ-卡拉胶酶的酶学性质测定表明,其最适反应温度和最适反应pH分别为60°C和7.5,在50°C以下和pH 7.0–9.0时酶活力较稳定,特异性降解κ-卡拉胶,在60°C、pH 7.5条件下以κ-卡拉胶为底物时Km值和Vmax值分别为2.28 g/L和147.06μmol/(min·mg),Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+等对酶活有显著的促进作用,而Ag+、Zn2+、Cd2+及SDS对酶活有强烈的抑制作用,这些性质不同于已报道的κ-卡拉胶酶。以羧基功能化的Fe3O4纳米粒子为载体,戊二醛为交联剂,在戊二醛浓度为2.5%、游离κ-卡拉胶酶浓度为13.9 U/20 mg载体、交联时间为2 h、固定时间为2 h、固定温度为25°C时获得最高的固定化κ-卡拉胶酶活力及酶活回收率,分别为326.0 U/g和46.9%。FTIR图谱表明κ-卡拉胶酶成功固定到了载体上,得到粒子直径约为15 nm的固定化酶,固定化后粒子间空隙减小,结构紧密,具有良好的超顺磁性;元素分析及热重分析验证了κ-卡拉胶酶固定到载体上后各元素及质量变化;Zeta电位及粒径分析表明固定化酶在去离子水中以酶连聚集体胶粒稳定存在。固定化κ-卡拉胶酶的酶学性质研究表明,其最适反应温度和最适反应pH分别为55°C和7.5,50–65°C时保持最高酶活力的80%以上,pH 5.0–9.0时酶活力稳定性较好,重复利用4次后保持初始酶活的40%以上;在4°C下的半衰期为20.6 d(而游离酶在4°C下的半衰期为17.4 d),提高了18.4%,固定化酶的Km为22.5 mg/mL;经ESI-TOF MS鉴定,固定化κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶的终产物为κ-卡拉胶二糖和κ-卡拉胶四糖,表明固定化过程未影响κ-卡拉胶酶的催化降解功能。