【摘 要】
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苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）广泛存在于各种生物体内，参与生物体的糖代谢、脂代谢等多种代谢途径。其主要功能是催化苹果酸与草酰乙酸的可逆转化。除此之外苹果酸脱氢酶还与植物的抗逆胁迫相关。本研究利用3’,5’-RACE技术，从棉花叶片中克隆出苹果酸脱氢酶基因，命名为GhMDH。把GhMDH基因分别插入到pET-23b和pBin438上，构建了原核表达载体pET-23
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苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）广泛存在于各种生物体内，参与生物体的糖代谢、脂代谢等多种代谢途径。其主要功能是催化苹果酸与草酰乙酸的可逆转化。除此之外苹果酸脱氢酶还与植物的抗逆胁迫相关。本研究利用3’,5’-RACE技术，从棉花叶片中克隆出苹果酸脱氢酶基因，命名为GhMDH。把GhMDH基因分别插入到pET-23b和pBin438上，构建了原核表达载体pET-23b-GhMDH和真核表达载体pBin438-GhMDH。将pET-23b-GhMDH导入大肠杆菌（E. coli） BL21（DE3）中进行酶蛋白的诱导和表达；将pBin438-GhMDH导入农杆菌（Agrobacterium tumefacious）菌株LBA4404中，通过农杆菌介导法获得转基因烟草植株，并进行了耐铝性分析。获得的主要研究结果如下：1.根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物，利用3’,5’-RACE技术，以“中棉所35”的RNA进行目的片段5’和3’末端的扩增。将5’-RACE和3’-RACE产物电泳检测、回收并连接到pGEM-T载体上，获得重组质粒pGEM-T-GhMDH，转化大肠杆菌感受态DH5α细胞获得阳性克隆进行序列测定，将测序结果用DNAMAN进行拼接，结果表明GhMDH基因全长1130bp，开放阅读框1014bp，编码338个氨基酸，预测的蛋白分子量为35.495KDa，等电点pI=8.94。2.双酶切克隆载体pGEM-T-GhMDH和原核表达载体pET-23b，回收目的基因以及载体片段，定向连接构建了原核表达载体pET-23b-GhMDH。通过热激法将pET-23b-GhMDH导入大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG进行蛋白诱导，诱导出大小约为35KDa的MDH蛋白，并通过测该酶在反应体系L-苹果酸与NAD反应下生成NADH量进而测NADH在340nm处吸光值的变化来对该蛋白进行酶活性测定，经计算GhMDH的活性为2.58U，比活力为129U/mg。3.双酶切克隆载体pGEM-T-GhMDH和真核表达载体pBin438，回收目的基因以及载体片段进行连接构建了植物表达载体pBin438-GhMDH。采用电激法转化烟草，获得9株转化植株，对经PCR和RT-PCR检测呈阳性的8株转基因植株进行耐铝性测定，结果表明转基因植株对铝毒的耐受性明显高于对照植株。
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