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目的探索不明原因复发性自然流产患者(Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion, URSA)子宫蜕膜中抑制性杀伤免疫球蛋白样受体(Killer Immunoglobulin-like Receptor, KIR)的表达和调控机制,分析抑制性KIR与不明原因复发性自然流产相关的分子生物学机制。材料及方法1.选择30例不明原因连续发生三次或三次以上自然流产的患者作为研究组,30例同期妊娠并且曾经正常分娩过至少一个胎儿的正常妊娠者作为对照组。2. TRIZOL法抽提子宫蜕膜组织总RNA,逆转录后,qRT-PCR分别检测两组子宫蜕膜组织中KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5mRNA相对表达量。3.含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白质裂解液抽提子宫蜕膜组织蛋白质,采用BCA法进行蛋白定量,通过Western blot技术进行KIR2DL2蛋白质相对表达量检测。4.应用QIAGEN公司Genomic DNA Kits试剂盒抽提DNA,亚硫酸氢盐修饰后,进行基因目的片段扩增,应用焦磷酸测序进行KIR2DL2基因启动子区甲基化率的检测。5.收取正常妊娠者子宫蜕膜进行原代蜕膜细胞培养,免疫荧光技术鉴定子宫蜕膜细胞,采用KIR2DL2单基因siRNA与lipo2000共转染,干扰KIR2DL2表达,48小时抽提蜕膜细胞RNA, qRT-PCR法检测KIR2DL2基因mRNA相对表达量,72小时提取蜕膜细胞蛋白质,Western blot技术检测KIR2DL2蛋白质相对表达量,构建体外子宫蜕膜细胞系。结果1.不明原因复发性自然流产组和正常妊娠组在年龄、身高、体重、初潮年龄、月经周期,行经天数等方面无差异。2. qRT-PCR检测发现,子宫蜕膜组织KIR2DL2在不明原因复发性自然流产组的mRNA相对表达量显著低于对照组,并具有统计学差异(P<0.05)。子宫蜕膜组织KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DL4和KIR2DL5在不明原因复发性自然流产组和正常妊娠组mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。3.不明原因复发性流产组子宫蜕膜组织KIR2DL2蛋白质相对表达量显著低于正常妊娠组,并具有统计学意义(P<0.05)。4.焦磷酸测序发现在不明原因复发性自然流产组和正常妊娠组子宫蜕膜组织KIR2DL2基因启动子区DNA甲基化率无显著差异(P>0.05)。5.原代子宫蜕膜细胞培养,光镜下观察发现细胞形态呈梭形,不规则多角形或星形；免疫荧光鉴定蜕膜细胞可达95%；采用KIR2DL2单基因siRNA-lipo2000共转染后,KIR2DL2蛋白质相对表达量降低,完成体外子宫蜕膜细胞系的构建。结论1.不明原因复发性自然流产患者蜕膜组织中基因KIR2DL2转录和翻译水平表达量显著下降。2. KIR2DL2表达下降可能不是通过DNA甲基化修饰调控,可能是通过其他通路或者其它修饰调节来完成,需要进一步研究。3.成功构建体外子宫蜕膜细胞系,为探索KIR2DL2缺乏与不明原因复发性自然流产关联性研究奠定原代细胞培养基础。