论文部分内容阅读
土壤是陆地生态系统中的主要碳（C）储库,参与全球碳循环,与全球气候变化密切相关。土壤中的自养微生物能够同化大气中的二氧化碳（CO2）,根据其能量来源可分为光能自养型和化能自养型,在土壤C固定过程中起到不可忽视的作用。土壤自养微生物固定CO2的方式有多种,其中的卡尔文循环（Calvin-Benson-Bussham cycle）具有最高的固定效率,且广泛存在于多数自养微生物中。卡尔文循环的限速步骤为1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（RubisCO酶）所催化的CO2同化过程,因此RubisCO酶活性及编码该酶基因大亚基的cbbL基因已经广泛用于土壤自养微生物生态学的研究中。当前,以cbbL基因和RubisCO酶活性作为分子标识的研究表明,土壤自养微生物生态学特性对外界环境的干扰具有显著的响应特征,但关于紫色土中自养微生物对不同环境因子的响应研究并不多见。鉴于此,本研究首先以连续26年（1991-2017年）的长期定位施肥中性紫色土为研究对象,结合Illumina Miseq测序探讨长期施肥对该土壤自养细菌活性和群落结构的影响,找出控制土壤自养菌生态特征的主导因素。随后,通过室内的微宇宙培养试验,进一步探索土壤含水量、pH和光照等重要环境因子对紫色土自养微生物的影响。由于对长期施肥紫色土的研究表明,硫氧化微生物可能是该土壤中的重要自养菌类群。最后,通过13C-CO2稳定同位素标记的添加无机还原态硫（Na2S）的土壤培养实验,利用DNA-SIP技术探索能源物质（无机硫化合物）对紫色土自养微生物的影响。通过上述研究,以期为制定合理的提高土壤C库含量的农田管理措施提供一定的理论依据,同时为进一步深入探讨土壤自养微生物生态学特征打下基础。主要研究结果如下:（1）选择经历26年长期定位施肥的5个紫色土处理,包括不施肥（CT）、施氮磷肥（NP）、施氮钾肥（NK）、施磷钾肥（PK）和施氮磷钾肥（NPK）处理,测定各处理土壤的基本性质及RubisCO酶活性,利用定量PCR和Illumina Miseq测序分别检测各处理土壤cbbL基因的丰度及群落组成,进而探讨施肥对紫色土自养微生物活性及群落组成的影响。主要结果如下,经过26年的长期定位施用化肥,有最高pH（7.55）的CT处理的RubisCO酶活性显著高于其它各施肥处理（P<0.01）,但其cbbL基因丰度最低。土壤RubisCO酶活性与土壤pH值显著正相关（R2=0.67,P<0.001）;cbbL基因丰度与土壤有效氮含量显著正相关（R2=0.54,P<0.01）,与pH显著负相关（R2=0.30,P<0.05）。同时,土壤RubisCO酶活性与cbbL丰度显著负相关（R2=0.67,P<0.001）。此外,CT处理中cbbL基因的多样性指数最低,表明施肥对土壤cbbL基因丰度有促进作用。土壤pH、有效氮、总氮和有机质是决定土壤cbbL群落结构的关键因子,硫氧化菌（Sulfuricaulis limicola）是各处理土壤中丰度最高的已知cbbL编码细菌。综上,26年的长期定位施用化肥改变了土壤中细菌cbbL的群落结构,土壤pH和有效氮是影响土壤自养微生物生态学特性的重要因子。（2）通过室内培养试验,研究土壤水分含量对紫色土自养微生物丰度与活性的影响。设置4个不同土壤含水量（质量百分比）的处理,分别为10%（W10）、15%（W15）、25%（W25）及淹水（WL）,于室温下培养28d。分别于培养的第3、7、14、28d取样,测定土壤有机碳含量、cbbL基因丰度、RubisCO酶活性,并分析它们之间的相关性。结果表明:土壤cbbL基因丰度于培养的前14d呈现随含水量增加而升高的趋势,且淹水处理（WL）在整个培养期间其cbbL丰度均处于最高水平。各处理土壤的RubisCO酶活性在培养初期（第3d）无显著差异,培养后期（第28d）低含水量（W10和W15）处理中RubisCO酶活性显著低于高含水量的W25及WL处理（P<0.05）。单因素重复检测方差分析的结果表明,含水量能够显著影响土壤有机碳含量（F=11.91,P=0.03）、cbbL丰度（F=42.33,P<0.01）和RubisCO酶活性（F=51.55,P<0.01）。相关性分析表明,土壤cbbL丰度与RubisCO酶活性间呈显著正相关（R2=0.23,P<0.01）,而它们均与土壤有机碳含量呈显著负相关。综上,土壤水分含量是影响紫色土自养微生物丰度和活性的关键因子,它们均有随含水量升高而增加的趋势,此结果可为揭示土壤碳转化对土壤湿度变化的响应机制提供重要的基础信息。（3）自养微生物包括光能自养和化能自养型,它们在土壤碳固定中起到不可忽视的作用。然而,这两种自养微生物在土壤固碳中相对贡献的报道还不多见。本研究采集酸性（ACI）、中性（NEU）及碱性（ALK）三种紫色土,分别置于自然光照和黑暗环境中室温培养。分别于培养的第7、45d取样,测定其RubisCO酶活性、cbbL基因丰度、呼吸速率和有机碳含量,从而比较分析光照对不同pH紫色土碳同化活性的影响。结果表明,整个培养期间,光照条件下各处理土壤的RubisCO酶活性和cbbL基因丰度均显著高于黑暗条件（P<0.01）。光照条件下NEU处理中RubisCO酶活性和cbbL丰度均显著高于ACI和ALK处理（P<0.01）,黑暗条件下不同pH土壤的RubisCO酶活性于整个培养期间均无显著差异。相关性分析结果表明,土壤RubisCO酶活性与cbbL丰度间呈显著正相关（R2=0.39,P<0.01）,与呼吸速率（R2=0.40,P<0.01）和有机碳含量（R2=0.08,P<0.01）呈显著负相关关系。综上,本实验再次证实pH是影响紫色土自养微生物丰度和活性的重要因子;土壤中光能自养微生物的生长对pH更加敏感,且其在中性环境中同化CO2的潜力高于酸性和碱性环境。此结果可为进一步揭示土壤碳转化对土壤pH和光照变化的响应机制提供重要的基础信息。（4）研究内容（1）的结果表明,硫氧化微生物（Sulfuricaulis limicola）是目标紫色土中的重要化能自养菌。因此,本部分实验利用13C-CO2标记的稳定性同位素核酸探针技术（DNA-based stable isotope probing,DNA-SIP）进一步探究紫色土自养微生物对不同含硫（还原态无机硫,Na2S）量的响应。设置不添加Na2S（CT）、添加5mg·kg-1 Na2S（LS）、添加10mg·kg-1 Na2S（HS）三种处理,分别用12CO2和13CO2标记培养,于室温下分别培养7、28d后取样,检测土壤被13C标记量,测定土壤cbbL基因丰度、RubisCO酶活性、呼吸速率和有机碳含量。结果表明,部分13CO2成功标记到自养微生物上,培养7d时,12CO2-HS处理的RubisCO酶活性显著高于12CO2-CT（P<0.05）,13CO2-HS处理的cbbL基因相对丰度最高峰处浮力密度显著大于13CO2-CT和13CO2-LS处理;28d后各处理的RubisCO酶活性间均无显著差异,13CO2-CT处理的最高峰处浮力密度显著大于13CO2-LS和13CO2-HS处理。各处理间cbbL丰度、有机碳含量和呼吸速率于整个培养期间均无显著差异。因此,土壤含硫量可能不是影响土壤自养微生物丰度的主要因素,但短期培养条件下,土壤高含硫量可能会影响自养微生物的活性,硫的添加可能激发了该土壤硫氧化自养微生物的生长。