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本文主要以吉安产大粒车前子为研究对象,首先根据古医籍文献中有关车前子作用的描述及国外对欧车前的研究成果,运用中药复方研究中“有效成分组”的概念,对车前子单味复方及分子量大小不同组分进行了相关活性实验,根据试验观察结果,对车前子的基本营养成分以及苯乙醇苷、低聚糖、多糖等成分进行了组成及部分功能研究,取得了一些创新性成果。这些结果可为拓展车前子新的食用和医用空间,深入进行车前子的生物学和医药学研究、进而开发新型车前子保健产品奠定坚实的理论和实践基础。本文主要研究结果概述如下:
古医籍文献记载车前子有“久服轻身耐老”、“养肺强阴,令人有子”等作用。“肾主骨生髓”,现代免疫学认为骨髓是重要的免疫器官,随着年龄增大,机体免疫功能下降或紊乱。车前子可能有补肾调节免疫功能的作用。为了解该功效,采用地塞米松(Dex)和环磷酰胺(Cy)免疫抑制剂建立免疫功能低下小鼠模型,观察了车前子水提液对模型小鼠免疫功能的影响。在此基础上,以外周血象、骨髓造血祖细胞集落培养、CD34+、脾脏指数等为指标,进一步观察了车前子水提液的80%乙醇醇沉上清液(车前L)对3.5Cy60Coγ射线致小鼠血虚证模型的影响。结果表明:车前子水提液能显著增强Dex模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用、吞噬消化功能及血清溶血素抗体生成水平,使之接近正常水平;明显提高Cy模型小鼠T、B淋巴细胞增殖能力及脾脏、胸腺重量和指数。车前L对辐射致血虚证小鼠外周血白细胞数量的恢复、CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-mix、CD34+数量的回升、脾脏指数增加均有显著的促进作用。
营养与免疫是基础营养学研究的一个非常活跃的领域,合理营养是维持正常免疫功能的重要条件。本文采用现代分析技术,对不同产地不同品种车前子的基本营养素进行了较全面的分析。
在对基本营养素进行研究的基础上,重点对车前子中可能的免疫调节成分进行了研究。肾为免疫之本,有研究表明苯乙醇苷类化合物是中医补肾壮阳之名药肉苁蓉的主要有效成分。低聚糖有促进肠道双歧杆菌等益生菌的增殖作用,肠道正常菌群可以合成维生素B1、B2、B6、B12、泛酸和叶酸等B族维生素,还可以帮助铁的吸收,这些都是机体正常造血功能所必须的营养物质。为进一步分离追踪车前子调节免疫功能的活性物质,本文以车前子L组分中的苯乙醇苷类化合物和低聚糖为目标物进行了研究。实验以乙酸乙酯-水(1:1,v:v)为溶剂系统,首次采用高速逆流色谱法,从车前子中分离得到化合物Ⅰ和化合物Ⅱ,其得率分别为89.8%和84.1%,HPLC纯度分别为98.4%和94.2%。所制备的化合物经高效液相色谱、紫外可见光谱、大气压化学电离负离子模式下液质联用技术(LC-APCI-MS)鉴定,并经核磁共振仪(MR)确认为类叶升麻苷及异类叶升麻苷。异类叶升麻苷为首次从车前子中分离得到的化合物。通过该实验建立了一种采用高速逆流色谱从车前子中分离制备类叶升麻苷及其异构体的简便、有效的方法。
在对车前L组分中低聚糖的研究中,以总含糖量、低聚糖含量及得率、树脂吸附容量为指标,考察了车前子总糖的提取条件、乙醇浓度对车前子低聚糖精制的影响及7种不同型号大孔树脂的优化选择条件。结果表明:15倍量水煮沸提取2次,每次1h为其最佳提取条件,最佳醇沉浓度为80%,最佳大孔树脂是2号。在此基础上研究了一种适用于工业化生产的大孔树脂精制车前子低聚糖的方法。此外,还发展了一种以硅胶干柱层析-溶剂结晶法分离纯化制备车前子低聚糖纯品(PCTOⅠ)的方法,其最佳展开剂为正丁醇:水:冰乙酸(0.72:0.02:0.26)。对实验所得PCTOⅠ纯品运用了二级质谱联用(MS-MS)、IR、1H-NMR、13C-NMR、GC-MS、高效离子交换色谱等多项现代分析技术对其进行解析。结果表明:PCTOⅠ分子是一个由半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成的三糖,分子量为504Da,其连接方式可能是以a-糖苷键连接。目前尚未见车前子中含有该种三糖的文献报道。
车前子多糖是车前子中的主要活性成分。在多糖研究中,采用蒽酮-硫酸比色法测定其含量,对我国同属不同品种、不同采集时间及炮制前后车前子中的多糖含量进行了比较研究。结果表明:江西吉安产大粒车前子生品多糖含量在9.15%~9.83%之间,炮制后其多糖含量在6.29%~6.81%之间;南昌新祺周车前GAP标准基地的大粒车前子生品多糖含量为7.85%~8.38%,炮制后其多糖含量为6.01%~6.64%;东北产的小粒车前子生品多糖含量为6.61%,炮制后其多糖含量为6.45%。同时研究发现车前子多糖含量较稳定,不因贮藏时间而变化,但炮制后会下降。
本文首次运用生物大分子纯化系统,采用凝胶柱层析法从车前子中分离、纯化得到多糖组分。通过高效凝胶色谱法分析表明该车前子多糖为均一多糖。以己知分子量的T-10、T-40、T-70标准葡聚糖和蓝色葡聚糖为标准作出标准曲线,测得该车前子多糖分子量为891kDa。GC-MS分析结果确定这一车前子多糖是由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖构成的杂多糖,其摩尔比为5.6:9.4:1.3:1。从单糖组成的数目和种类来看,尚未见文献报道车前子中含有该种多糖。
为提高多糖得率、缩短提取时间,本文还研究了微波技术在车前子多糖提取中的运用。通过正交试验确定提取的最佳工艺参数为:车前子与水的质量比为1:15,在微波强度为60%的条件下提取65s。与其它方法比较,微波提取方法时间短,得率高。
为发掘我国车前子的临床新用,研究中以阿莫西林钠盐致小鼠阴道菌群失调模型,观察了车前子精制多糖对它的影响以及车前子精制多糖对正常小鼠肠功能的影响。结果表明:精制车前子多糖能显著提高模型小鼠阴道乳杆菌的数量,使之接近正常水平,说明精制车前子多糖能促进小鼠阴道内乳杆菌的生长,对阴道菌群失调有调节作用。车前子精制多糖能显著促进正常小鼠小肠的蠕动,增加大、小肠的含水量,使肠容积变大,从而软化大便,有利于大便的排出。用车前子多糖对老年小鼠连续30d喂养实验表明,各给药组小鼠结肠壁厚度、粘膜厚度、绒毛高度和绒毛表面积与对照组相比均有非常显著性差异,提示车前子多糖对老年小鼠肠粘膜组织的退化具有改善作用。
在上述研究及对便秘产品市场分析的基础上,以现代营养学知识结合传统中医药理论,首次提出对于中老年功能性便秘应以营养肠道、预防肠功能衰退为主的观点,确立“营养肠道、益气健脾、行气助运、养血活血”为其预防原则,以车前子为主要原料,配以国家卫生部批准的可用于保健品的其它中药制成车前蜜膏,对110例中老年功能性便秘者进行了4周的随机对照试食试验。结果表明:车前蜜膏总有效率达90.6%,能缩短相邻两次排便的时间,平均每日排便次数、排便量、排便困难感均优于对照组。