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NADH依赖型氧化还原酶广泛应用于精细化学品和手性化合物的生物合成,NADH的再生保障了生物氧化还原过程的进行。甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase,FDH,EC 1.2.1.2）是氧化还原酶辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的关键酶,它可以将甲酸氧化为C02,同时将NAD+还原为NADH。甲酸/甲酸脱氢酶作为NADH再生系统,其优势在于反应不可逆,甲酸价格低廉且很多酶对此有很高的耐受性;此反应只产生一种副产物C02,对任何酶的活性均没有任何影响,且很容易从反应体系中释放出来,有利于产物的分离、纯化。在需要辅酶NADH再生的反应中,甲酸脱氢酶具有重要的应用价值和产业化应用前景。本课题采用重叠延伸PCR技术,按照毕赤酵母的碱基偏好性设计基因序列,人工合成编码FDH的基因fdh,并在E.coli BL21（DE3）中得到高效表达;构建了 FDH酵母穿梭质粒,并在毕赤酵母（Pichia pastoris）X33中实现分泌表达;为了提高FDH的稳定性,采用融合PCR方法对FDH基因进行了定点突变。主要结果如下:（1）采用基因合成的方法合成fdh基因,测序结果表明基因大小为1203 bp,应用DNAClub软件进行基因序列比对,核酸序列一致性为100%,说明合成出来的fdh基因与设计的基因序列完全一致,合成过程中没有出现碱基错配。应用DNAClub软件,将核酸序列翻译成氨基酸,在NCBI数据库中进行BLAST比对,与数据库中FDH 的氨基酸序列（P33160.3）、Mycobacteriumvaccae（AAB36206.1）的同源性达到99%,与 silocella vestris BL2（YP002362742.1）、Starkeya novellaDSM 506（YP003695165.1）、Sphingobiursp.SYK-6（YP004835047.1）、Azospirillumsp.B510（YP003452797.1）、MicrolunatusphosphovorusNM-1（YP004572388.1）、Paracoccusdenitrifcans PD1222（YP914964.1）的同源性在 80%以上。（2）构建了原核表达载体pET-fdh。经过诱导,fdh基因能在E..coli BL21（DE3）中高效表达。其粗酶比活为608 U/mg。诱导条件为:当OD595达至0.6时,加入终浓度为1 mM的IPTG诱导,16℃培养。（3）构建了酵母穿梭质粒pGAPZfdh,转化至毕赤酵母X33。通过初筛、复筛得到2个FDH酶活较高的转化子。在YPD培养基中培养,发酵上清液中含有fdh基因表达的目的酶,测其粗酶比活分别为951.4 U/mg、1124.3 U/mg。（4）通过定点突变的方法,将fdh氨基酸序列中的第145位和第354位氨基酸Cys突变为Ala。将突变后的fdh与原核表达载体连接,重新构建的原核表达载体,诱导表达产生的FDH,比活力较突变前变化不明显,但稳定性显著提高,半衰期分别为:突变前24 h,突变后72 h,热稳定性提高了 3倍。