研究目的巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分,对机体的免疫和炎症不可或缺。近年来,巨噬细胞的糖酵解与其功能之间的联系成为人们研究的热点。糖酵解在巨噬细胞炎性激活中发挥关键作用。缺氧诱导因子(HIF-1α)是巨噬细胞的代谢开关,是巨噬细胞糖酵解的关键调控因子。右美托咪定(DEX)已被证明具有抗炎作用,然而,DEX的抗炎作用与HIF-1α依赖的糖酵解是否相关尚不清楚。本文研究了DEX在LPS诱导的巨噬细胞炎性激活中的作用及其机制。研究方法1.观察DEX对巨噬细胞炎性反应的作用体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞(PM)和小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),用LPS和DEX分别或同时刺激细胞,6h后收集细胞和上清,ELISA法检测炎症因子TNF-α和IL-6的水平,Q-PCR法检测TNF-α和IL-6的mRNA表达水平。2.探讨糖酵解在DEX抗炎中的作用首先观察DEX对糖酵解的影响。体外分离培养PM和BMDM,用LPS和DEX分别或同时刺激细胞,6h后收集细胞和上清,测定上清中的细胞外酸化率(ECAR),葡萄糖和乳酸的浓度,检测糖酵解关键酶GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达水平。随后用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)预处理增强巨噬细胞的糖酵解,观察DEX对糖酵解及炎症因子的影响。体外分离培养PM和BMDM,GM-CSF预孵育3h,用LPS和DEX分别或同时刺激细胞,6h后收集细胞和上清,测定上清中的葡萄糖和乳酸的浓度,检测糖酵解关键酶GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达水平,以及炎症因子TNF-α和IL-6的水平。3.探讨HIF-1α在DEX抑制糖酵解和炎症中的作用首先观察DEX对HIF-1α的影响。体外分离培养PM,用LPS和DEX分别或同时刺激细胞,6h后收集细胞和上清,Q-PCR法检测HIF-1α的mRNA表达水平,Western blotting法检测HIF-1α的蛋白水平。随后用质粒过表达巨噬细胞的HIF-1α,观察DEX对糖酵解及炎症因子的影响。培养RAW264.7细胞系,转染空白载体和HIF-1α特异性载体24h,用LPS和DEX分别或同时刺激细胞,6h后收集细胞和上清,测定上清中的葡萄糖和乳酸的浓度,检测糖酵解关键酶GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达水平,以及炎症因子TNF-α和IL-6的水平。结果1.观察DEX对巨噬细胞炎性反应的作用在PM与BMDM中,LPS组的TNF-α和IL-6水平及mRNA表达显著增加,DEX处理组的TNF-α和IL-6水平及mRNA表达较LPS组明显降低,说明DEX对LPS诱导的TNF-α和IL-6的释放有抑制作用。2.探讨糖酵解在DEX抗炎中的作用在BMDM中,LPS组的ECAR显著增加,而DEX处理组的ECAR较LPS组降低。在PM中,LPS组的葡萄糖浓度降低、乳酸浓度增加,GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达增加,而DEX处理组的葡萄糖浓度较LPS组增加、乳酸浓度较LPS组降低,GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达较LPS组下降。实验说明,DEX可抑制巨噬细胞的糖酵解能力及糖酵解关键酶的表达。在PM中,与LPS组相比,DEX处理组的葡萄糖消耗、乳酸生成减少,GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达降低,而预孵育GM-CSF后,DEX处理组的葡萄糖消耗、乳酸生成及GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达较LPS组无显著差异。同样,与LPS组相比,DEX处理组的TNF-α和IL-6水平降低,而预孵育GM-CSF后,DEX处理组的TNF-α和IL-6水平较LPS组无显著差异。通过该部分实验证明,增强糖酵解可逆转DEX的抗炎作用,说明糖酵解与DEX的抗炎作用相关。3.探讨HIF-1α在DEX抑制糖酵解和炎症中的作用在PM中,LPS组的HIF-1α的mRNA表达和蛋白水平增加,而DEX处理组的HIF-1α的mRNA表达和蛋白水平较LPS组下降。在RAW264.7细胞中,与LPS组相比,DEX处理组的葡萄糖消耗、乳酸生成减少,GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达降低,而过表达HIF-1α后,DEX处理组的葡萄糖消耗、乳酸生成及GLUT1、HK2和PFKFB3的mRNA表达较LPS组无显著差异。同样,与LPS组相比,DEX处理组的TNF-α和IL-6水平降低,而过表达HIF-1α后,DEX处理组的TNF-α和IL-6水平较LPS组无显著差异。以上实验说明,DEX抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应至少部分通过对HIF-1α依赖的糖酵解的调节。结论DEX可抑制巨噬细胞HIF-1α依赖的糖酵解以及炎症因子TNF-α和IL-6的分泌,增强糖酵解或过表达HIF-1α,可逆转DEX的抗炎作用,因此,DEX可能部分通过抑制HIF-1α依赖的糖酵解而发挥抗炎作用。