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以纯化的Gα0和GAP-43蛋白及GST-GAP-43融合蛋白为对象,利用多种生物化学和生物物理学方法研究了Gα0蛋白的棕榈酰化对其寡聚化性质以及[35S]-GTPγS结合活性的影响,研究了棕榈酰化对Gα0蛋白与GAP-43(GST-GAP-43)相互作用的影响,并对Gα0蛋白中与GAP-43相互作用的结构微区进行了探索。
聚丙烯酰胺活性凝胶电泳和p-PDM化学交联分析表明,基态的Gα0(GDP结合态)以寡聚体的形式存在,GTPγS的激活处理会导致Gα0寡聚体解聚为单体;但是当Gα0被棕榈酰化修饰之后,基态Gα0的寡聚化增强,GTPγS处理也很难使其彻底解聚。放射性自显影的方法检测[14C]-palmitoyl标记的Gα0进一步证实,棕榈酰化Gα0形成的寡聚体经GTPγS处理完全不能解聚。采用分子筛层析,分析超离心和原子力显微镜等手段检测棕榈酰化前后Gα0寡聚化状态的结果一致表明,棕榈酰化修饰使Gα0的寡聚化程度显著增强。与此相对应的是,棕榈酰化Gα0的[35S]-GTPγS饱和结合活力为7.2nmol/mg,明显低于非棕榈酰化Gα0者(21.8nmol/mg)。综上结果,Gα0蛋白的棕榈酰化-去棕榈酰化转换可以调控其寡聚化状态,而寡聚化状态的变化与Gα0的GTPγS结合活性状态相关。
为了进一步了解棕榈酰化影响Gα0寡聚化及活性的构象变化基础,测定了棕榈酰化前后Gα0色氨酸内源荧光及荧光淬灭,结果显示,棕榈酰化后Gα0的色氨酸内源荧光发射峰位置基本不变,但荧光强度降低,而且荧光淬灭效率降低。上述结果提示棕榈酰化后的Gα0分子之间形成更为紧密的结构状态。用特异性荧光探针BODIPYFL-GTPγS对Gα0蛋白的构象变化研究表明,棕榈酰化之后Gα0的GTP结合域微区的“空间位阻”增强,呈现更加紧密的构象。
GAP-43和Gα0富含于中枢神经系统中,是与中枢神经生长相关的蛋白,两者在组织定位和功能上密切相关,但Gα0的棕榈酰化是否影响它们的相互作用迄今未见报道。测定GAP-43对棕榈酰化前后Gα0的活性及寡聚化状态影响的结果表明,GAP-43对Gα0的GTPγS结合活性的促进作用与Gα0蛋白本身的棕榈酰化状态有关,GAP-43对非棕榈酰化Gα0的激活作用较对棕榈酰化Gα0更强,达到50%最大激活所需的GAP-43的量前者仅为后者的1/10。测定GST-GAP-43融合蛋白对棕榈酰化前后Gα0的激活作用的影响时亦获得与GAP-43类似的结果。聚丙烯酰胺活性凝胶电泳和p-PDM化学交联的结果表明,GAP-43抑制未棕榈酰化的Gα0·GDP的寡聚体形成,但不影响棕榈酰化的Gα0的寡聚化状态。
为了解GAP-43对Gα0的激活是否与Gα0的C-末端微区结构相关,构建和表达C-末端不同长度氨基酸序列缺失的GST-Gα0融合蛋白,并根据Gα0蛋白C-末端14个氨基酸序列人工合成小肽P14,测定P14和GST-Gα0融合蛋白的缺失突变对GAP-43促进Gα0的结合活性的影响。结果表明,P14小肽增加Gα0的GTPγS结合活性,C-端缺失导致Gα0的结合活性降低。GAP-43对Gα0的激活作用因其C-末端14个氨基酸的缺失而基本消失,而P14的加入也降低GAP-43对Gα0的激活。这些实验结果表明,Gα0蛋白含14个氨基酸的C-末端可能是GAP-43的作用微区。
综合全文所获实验结果,对棕榈酰化修饰通过影响Gα0的寡聚化状态而调控其GDP/GTP的交换,从而参与G蛋白偶联的信号通路的调控提供了直接、有力的实验证据;而且,对从棕榈酰化角度研究GAP-43与Gα0的相互作用的机理提供了较明确的实验证据和新的线索。