一、目的与意义类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种古老的世界性疾病。流行病学调查结果显示，全世界成人发病率为0.5-1％。根据第15届国际关节炎与自身免疫病会议报道，我国成人RA患病率约为0.3％。RA有较高的致残率，患者往往承受巨大的心理压力，生活质量较常人明显降低。RA属于多因子疾病，其具体发病原因还不清楚。从总体上讲，该病是在遗传易感性的基础上，外界因素促发的一种疾病。易感基因如HLA-DR4、HLA-DR10、HLA-DQ与该病有强烈的关联。DR分子和DQ分子之间基因互补、相互作用，共同介导人类RA患病的基因易感性。除MHC以外，人类的基因库里尚有多达10-15万种基因参与RA的病理过程，与免疫识别、细胞因子及其受体、或总体上和炎症过程直接相关。此外，身高、体重、性别、情绪、气候、环境、抽烟等和RA的发病也有密切的关系。RA的病理机制研究也有长足的进展。T细胞谱系是认识RA病理机制的里程碑。目前较为流行的观点是RA为抗原呈递细胞和CD4+T细胞相互作用的结果。此外T细胞介导的关节炎症反应也与滑膜中TCRγδT细胞有关。Th1／Th2动态平衡的失调也是RA病理机制之一，其中恒定性自然杀伤性T细胞就可以产生保护性Th2细胞因子。但由于其特异性尚未得到确定，T细胞中心假说逐渐受到挑战。在滑膜增生反应中，滑膜T细胞的作用可能不是很显著，而巨噬细胞较之T细胞可能起着更为主要的作用。在RA相关的自身抗体中，作为RA的生物学标志，抗CCP抗体具有极高的特异性。动物试验表明，抗CCP抗体不仅仅是慢性炎症的一个附带现象，而是直接参与组织的损伤，放大RA炎症效应。细胞因子网络是RA病理破坏过程的关键环节。TNF-α被认为是细胞因子网络的中心，而MMP-1、MMP-3与RA联连接组织的破坏直接效应酶。除此之外，尚有部分白介素家族、趋化因子家族、生长因子家族等直接参与组织损伤。NF-κB、p38 MAPK是两个独立的胞内通讯通路，在细胞因子网络发生、扩大的过程中起关键作用。上述易感基因、自身抗体、T细胞谱系和细胞因子等之间在RA的发病过程中相对独立，但都不能完全解释RA的病理过程，这些机制之间又存在一定的联系，从而形成一个非常复杂的网络。病理机制的不确定性导致治疗上的多靶点和盲目性。尽管经典的免疫抑制疗法在很大程度上可以改善病情，甚至可以达到临床治愈，但免疫抑制剂的长期服用可以导致众所周知的副反应，如甲氨喋呤、环磷酰胺的胃肠道反应和肝功能损害，来氟米特(Leflunomid，LEF)引起月经不调、继发性肺部及皮肤炎症等，同时还存在疗效上的平台期。正因为如此，病人的依从性依然很差。近年来针对细胞因子网络各治疗靶点的生物制剂研究取得了较多成果。重组人Ⅱ型TNF-α受体抗体融合蛋白、重组人IL-1已经在临床上用于RA的治疗。而抑制p38 MAPK通路的各种制剂也正在试验中。这些生物制剂价格昂贵，存在一定风险，容易导致新的免疫紊乱，并受到适应症的限制，无法大范围推广。中医对RA痹证的病因病机早有清楚的认识，近年来各医家对“风寒湿”理论也作了较多的补充，中医药在RA的治疗上越来越发挥着重要作用。因此，如何大力开掘传统中医药的特长和潜在优势，加大传统效方的开发研究，是RA治疗中的一个迫切的课题。三水白虎汤(San Shui Bai Hu-decoction，SSBH)为临床自拟方，专为RA热痹证型而设，具有清热除湿、祛风通络、活血止痛的功效，主要用于RA活动期及炎症进展期，表现为关节红肿疼痛、局部灼热、伴有全身热象者。其药物涉及水牛角、寒水石、白芥子、虎杖、生地、鸡血藤等。肖长虹博士多年运用SSBH配合其他药物治疗RA热痹，取得肯定疗效，并在临床运用中不断加以改进。为进一步验证SSBH的疗效，初步探讨其部分基本药理机制，拟对SSBH进行临床研究，观察其对RA热痹各项临床及免疫学指标的影响；通过胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)动物模型试验，观察SSBH对CIA鼠病理改变的影响，并探讨其基本作用机制。二、方法与内容1．SSBH的临床观察采用随机对照的研究方法，对2005年5月至2006年10月于南方医院中医风湿科就诊的117名RA患者进行观察。按既定标准纳入的117例RA热痹证型患者随机分为两组，两组患者在年龄、性别、病程、症候特征以及实验室指标、用药情况上都具有可比性。对照组给予(58例)LEF治疗，治疗组(59例)在此基础上加服SSBH。疗程为1年。分别在治疗前、治疗2个月、6个月、1年后观察HAQ、ESR、CRP、IgG-RF、CCP-Ab等指标的前后变化。2．SSBH对大鼠CIA的影响选取CIA模型鼠33只，随机分为3组，即生理盐水对照组、SSBH组、LEF组，于致炎后第13天分别给予SSBH煎剂、LEF、生理盐水连续灌胃30天。给药过程中记录模型鼠的炎症积分和体重变化。在治疗前和治疗结束后，在麻醉状态下进行X光摄片，记录其影像学改变，并进行放射学评分(Radiological index，RI)。第43天后处死大鼠，膝关节、踝关节取材，常规切片HE染色，并进行组织学观察和评分。3．SSBH药理机制的初步探讨(1) SSBH对CIA NF-κB、MMP-1、MMP-3 mRNA表达的影响常规制作大鼠关节组织切片，用原位杂交的方法观察NF-κB、MMP-1、MMP-3 mRNA在关节局部组织的表达情况。用Olympus-CRI(Creative Realities，Inc．)显微摄像系统拍摄图片，并用图像分析软件Image Pro plus 6.0分析三组平均积分光密度(Mean integrated optical density，MIOD)、阳性表达面积均值(Mean of stained area，MSA)的差异。(2) SSBH对CIA TNF-α及p-P38MAPKα丰度的影响同时，用ELISA法测定大鼠血清中TNF-α含量的多少，比较三组的差异，检测大鼠关节组织匀浆细胞中磷酸化p38 MAPKα蛋白(p-P38MAPKα)的水平，比较三组不同的药物干预对关键信号转导途径中活化p38 MAPKα蛋白丰度的影响。三、结果与分析1．SSBH的临床观察两组在治疗2个月后总体疗效无显著差异。治疗6个月后，两组ACR50无显著差异，但治疗组的总体疗效显著好于对照组(H=-2.207，P=0.027)。治疗1年后，治疗组的总体疗效要显著好于对照组(H=-4.266，P=0.000)。治疗组ACR50缓解率(χ~2=23.493，P=0.000)、ACR70缓解率(χ~2=8.794，P=0.003)均显著高于对照组。从单个指标改善程度上看，在治疗2个月后，治疗组自觉痛评分(F=5.200，P=0.025)、疼痛关节个数(F=7.068，P=0.009)、HAQ(F=3.066，P=0.049)、IgG-RF(F=6.743，P=0.011)的改善程度均显著优于对照组。大多数指标改善程度在治疗6个月后两组无显著差异。在治疗1年后，治疗组自觉痛评分(F=13.387，P=0.001)、触痛评分(F=8.539，P=0.005)、疼痛关节个数(F=4.294，P=0.042)、肿胀关节个数(F=16.212，P=0.000)、HAQ(F=17.713，P=0.000)、CRP(F=15.247，P=0.000)、CCP-Ab(F=4.101，P=0.047)的改善程度，均显著高于对照组。在对照组，一些反应RA进展的指标CRP、RF、CCP-Ab在治疗1年后无继续改善，而治疗组不存在这种治疗上的“平台期”。大部分病人完成了1年以上的治疗，病人对SSBH联合免疫抑制剂治疗RA有更高的认同度。从起效时间来看，治疗组3周起效率显著高于对照组(χ~2=28.226，P=0.000)，说明中西医联合治疗RA，其起效时间更快。此外，治疗组皮质激素撤药率要显著高于对照组(χ~2=19.990，P=0.000)。从不良反应上看，治疗组不良反应发生率(χ~2=4.015，P=0.045)及因不良反应导致的撤药率(χ~2=5.768，P=0.018)也少于对照组。2．SSBH对CIA病理改变的影响药物干预后，SSBH组的炎症评分在一周内即开始改善，2周显著改善，而LEF组给药3周后才有显著改善。治疗后SSBH组的炎症评分显著低于对照组(F=9.941，P=0.000)。从病理观察结果来看，SSBH组膝关节(F=5.305，P=0.011)、踝关节(F=3.467，P=0.044)病理评分均显著低于对照组。治疗后三组膝(F=26.700，P=0.000)、踝关节(F=43.644，P=0.000)RI评分的改善度存在显著的差异。X片显示SSBH组膝、踝关节骨皮质变薄、侵蚀样改变、关节狭窄、融合等明显改善，膝关节(t=10.000，P=0.000)、踝关节(t=3.413，P=0.007)RI评分较治疗前均显著降低，而在对照组膝(t=2.502，P=0.031)、踝关节(t=-4.474，P=0.001)较治疗前显著加重。3．SSBH药理机制初步探讨治疗后在SSBH组，MMP-1(F=5.397，P=0.010)、MMP-3(F=3.330，P=0.049)的MSA均显著低于对照组，相应的MMP-1(F=4.634，P=0.018)、MMP-3(F=4.790，P=0.016)的MIOD亦显著低于对照组。在SSBH组，虽然NF-κBmRNA MSA与对照组比较无显著差异，但在综合考虑光密度因素后，其MIOD仍显著低于对照组(F=3.956，P=0.040)。治疗后SSBH组、LEF组血清TNF-α的含量(F=4.307，P=0.023)、组织匀浆p-p38mapkα的丰度(F=10.167，P=0.000)均显著低于对照组。四、结论1．SSBH与LEF联合应用治疗活动期RA，炎症的改善程度显著优于单纯运用LEF，并能获得更好的疗效。SSBH可以减缓LEF治疗上的“平台期”，与LEF联合应用治疗时间越长，其疗效越好。SSBH可以加快RA治疗的起效时间，提高皮质激素撤药率。HAQ结果也表明，SSBH可以提高病人的生活质量。SSBH有助于控制RA活动期及进展期炎症，同时还可以减轻单纯用LEF带来的不良反应。2．CIA动物试验表明，SSBH可以控制CIA的急性期炎症。SSBH还可以抑制CIA炎症发展过程中滑膜增生、纤维化、炎细胞的浸润、软骨和骨的破坏。3．SSBH对CIA的病理改变抑制作用的机理可能在于：SSBH可以减少CIA关节滑膜成纤维细胞内p38 MAPKα的激活，致使关节组织中p-p38 MAPKα的丰度降低；SSBH还可以抑制CIA MMP-1、MMP-3、NF-κB mRNA在关节局部的表达；SSBH可能对CIA内TNF-α的产生及其在细胞内的信号转导通路都有一定的抑制作用。