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背景和目的前列腺癌的发病率逐年升高,内分泌治疗在初期能获得满意疗效,但在一段时间后雄激素阻断治疗变为无效,肿瘤重新开始进展,最终发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),造成肿瘤局部复发,并多伴有全身转移。一旦当CRPC形成,的目前治疗手段疗效有限,肿瘤出现会快速转移,预后极差。因此,阐明前列腺癌发生进展的分子机制,为前列腺癌的治疗提供新的思路和方法有着迫切的临床需要。ELL2是前列腺癌的一个抑癌基因,在前列腺良性组织内高表达,ELL2的缺失或突变可诱导前列腺癌发生,是前列腺内环境稳定的重要因子。而肿瘤的发生,及其侵袭、转移、耐药等生物学行为均与DNA损伤和修复密切相关。本研究旨在明确ELL2对前列腺癌细胞DNA双链损伤的保护作用及探索其对DNA损伤修复的相关调节机制,从而为前列腺癌的基础研究提供新的视点,也为临床治疗前列腺癌提供新的思路。方法1.选取前列腺癌C4-2、LNCa P、PC-3和22RV1细胞株,设计针对ELL2的si RNA,将其和对照si RNA转染入细胞或者将已构建的Flag-ELL2质粒转染入细胞,再通过不同浓度的阿霉素和γ射线诱导DNA双链损伤,收集细胞行western blot检测DNA损伤标记物γH2AX的表达,并行彗星实验检测彗星的尾距。2.利用基于I-Sce I的DR-GFP同源重组检测系统和H1299d A3-1#1非同源末端连接检测系统,通过si RNA下调ELL2表达后,再转染外源性I-Sce I质粒,流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比,分析ELL2对两个修复通路的影响。3.将GFP标记的ELL2或GFP,和RFP标记的Ku70、Ku80或RFP转染入C4-2细胞中,利用Olympus共聚焦激光系统800μW能量的405nm微激光在细胞核原位制DNA双链断裂,并观察GFP-ELL2、RFP-Ku70、RFP-Ku80在DNA断裂末端聚集产生foci的应答效应。4.将Flag-ELL2、GFP-Ku70、GFP-Ku80转染入HEK293细胞中,进行外源性蛋白质免疫共沉淀;将阿霉素处理过和未处理过的C4-2细胞进行核质分离提取核蛋白,进行内源性蛋白免疫共沉淀,鉴定ELL2是否和Ku70/80蛋白相结合。5.通过si RNA下调ELL2表达后,将GFP-Ku70或GFP-Ku80转染入C4-2细胞中,利用微激光制造DNA双链断裂,在共聚焦显微镜下连续动态观察并记录DNA损伤后8分钟内GFP-Ku70或GFP-Ku80应答形成foci的情况。利用软件分析foci强度并绘制强度时间曲线。观察ELL2对Ku70/Ku80在DNA断端聚集的影响。6.设计只针对内源性ELL2而对外源性ELL2没有作用的si RNA,转入细胞后,将Flag-ELL2或Flag,和GFP-Ku70/Ku80共同转入细胞,连续动态观察并记录微激光制造损伤后8分钟内GFP-Ku70或GFP-Ku80应答形成foci的情况,观察挽救性上调ELL2表达后对Ku70/Ku80在DNA断端聚集的影响。结果1.在前列腺癌多个细胞系中,ELL2表达下调后,western blot检测到阿霉素或γ射线诱导的DNA损伤标记物γH2AX表达增加,彗星实验中慧星尾距明显增加。ELL2过表达后,γH2AX表达显著减弱。2.在HR检测系统中,转染I-Sce I质粒后引起了DNA双链断裂,并发生了HR修复,而下调ELL2表达并不影响DNA双链断裂的HR修复。在NHEJ检测系统中,转染I-Sce I质粒后引起了DNA双链断裂,并发生了NHEJ修复,下调ELL2表达使得DNA双链断裂的NHEJ修复水平减弱。3.ELL2、Ku70、Ku80对微激光诱导的DNA双链断裂有迅速应答效应,并且ELL2与Ku70/80共同聚集在DNA双链断裂部位。4.外源性Co-IP显示ELL2与Ku70、Ku80结合形成蛋白复合物,且ELL2与Ku80的结合程度较Ku70高。内源性免疫共沉淀结果显示阿霉素诱导的DNA损伤促进了ELL2与Ku70、Ku80的结合。5.下调ELL2的表达使Ku70/80在DNA双链断裂的断端聚集形成foci的强度减弱,挽救性过表达ELL2可增强Ku70/80在DNA双链损伤断端的聚集。结论1.ELL2对前列腺癌细胞的DNA损伤具有修复作用。2.下调ELL2表达后使DNA双链断裂的NHEJ修复途径减弱,而对HR修复途径没有影响。3.ELL2可以和Ku70、Ku80结合形成蛋白复合物,DNA损伤促进了它们的结合。ELL2对Ku70/80蛋白表达水平没有影响。4.ELL2和Ku70、Ku80在DNA双链断裂发生后,迅速聚集在DNA双链断裂部位形成foci,并且ELL2可以调节Ku70和Ku80在DNA断端的聚集来调控NHEJ修复。