长期过量使用化肥、农药和连茬耕作,造成了土壤退化、板结,土壤肥力下降、生产力降低,土壤微生物区系发生改变,病原微生物增加,土传病害发病严重,从而导致恶性循环,最终使作物品质下降,农药残留增加,药害肥害严重,严重阻碍农业的可持续发展,威胁到国家粮食安全。目前,对土传病害的防治措施包括物理防治、化学防治和生物防治。物理防治包括换土、暴晒消毒等措施,因其工程量大,实际应用效果不理想;化学防治手段会导致病原菌抗药性增加,对土壤和水体造成污染;生物防治主要利用生防微生物进行防治,而现在单一生防菌防病谱狭窄,防治效果不稳定。利用多种生防微生物防治可在土壤中植入大量的有益微生物,可以竞争、抑制病原菌,减轻病原压力,诱导植物抗性,促进植物生长,从而达到防治土传病害的效果。黑根霉(Rhizopus nigricans)和拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)是本实验室从土壤传播疾病严重地区的植物根际土壤中分离得到的具有生物防治活性的两种丝状真菌。本文以黑根霉和拟康氏木霉混合发酵液为基础,研究了混合发酵工艺,通过混合发酵化学成分的分析,发现该工艺增加了抗菌物质,增加了增加系统抗性的物质,增加了促进植物生长的物质,对土传病害防治效果显著,改良了土壤理化生性状和微生物区系,并且采前用该制剂处理农作物,还提高了采后储藏期果实品质。1.混合发酵液对植物土传病害的防治效果抑菌实验表明混合发酵液对多种植物土传病原菌具有抑制作用。混合发酵液对尖孢镰刀菌的抑制率达61.12%,孢子萌发实验与发酵液抑菌实验结果表明,混合发酵液抑菌率达到92.83%。确立了混合发酵工艺,最优组合为豆粕70 g/L,磷酸二氢钾0.4g/L,可溶性淀粉30 g/L。黑根霉与拟康氏木霉接种比例为1:1、1:4、1:9,接种量2%;混合发酵温度为28℃;发酵时间12 d;初始pH为6.5。黑根霉和拟康氏木霉混合比例为1:4的发酵液对链格孢的抑制效果最好,达到66.73%的水平,对灰葡萄孢的抑制效果达到84.87%的水平。田间实验中混合微生物制剂对黄瓜枯萎病和番茄灰霉病的相对防治效果达到85%以上,并且植物株高、各时期叶片数与茎粗均高于对照组。证明混合发酵液处理具有抗病促生的作用。SOD、POD、PAL等抗性相关酶活均有不同程度的提升。混合发酵比单独发酵产物变化明显,其中抗菌物质如酚类和芳香族化合物如水杨酸甲酯等含量显著增加,诱导植物抗性的寡糖类物质含量上升。这些实验结果初步表明了混合发酵液的抑菌促生机制。2.混合发酵液对土壤理化生性状和土壤微生物区系的影响土壤是农作物生长的基质,是支撑农作物生长的根本资源。土壤中存在大量的微生物,土壤-微生物-植物构成了一个微生态系统,与植物病害特别是土传病害密切相关。土壤是否健康是决定植物健康状况的重要因素之一,不健康的土壤生态极易导致植物土传病害的发生。经混合发酵液处理后,土壤理化性质差异明显。两年实验结果证明,土壤孔隙度、田间持水量、有机质含量、总氮、速效磷及速效钾显著升高,而土壤容重、pH值、铵态氮、硝态氮降低。土壤有机质、总氮、速效磷和速效钾的含量与混合发酵液施用量成正相关。处理后,土壤结构性变好,有机质含量增加,土壤熟化程度增加,养分含量增加。施用混合发酵液后,土壤脲酶、转化酶及过氧化氢酶的的活性都有较大的提高,促进了土壤微生物的繁殖和增强了相关酶的活性。施用混合发酵液后对土壤微生物的多样性产生了较为明显的提升。真菌方面,纲水平上的优势种群粪壳菌纲、银耳纲和散囊菌纲,处理后粪壳菌纲相对含量减少,而银耳纲和散囊菌纲相对含量增加。在属水平上,常见病原菌分布较多的赤霉菌属和镰刀 菌属在处理过后的土壤中相对含量下降明显。在种水平上,几种病原菌如立枯丝核菌、腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌的相对含量都有明显的减少。在细菌方面,在纲水平上酸杆菌纲相对含量减少,变形菌纲、放线菌纲和梭菌纲相对含量增加。科水平上黄色单胞菌科,产碱菌科相对含量增加显著。在种水平上,几种有益细菌如根瘤菌、慢生根瘤菌和硝化细菌的相对含量都有明显的增加。证明混合发酵液对于土壤内植物病原真菌的生长繁殖产生了抑制作用,调节土壤微生物区系,使其更利于植物生长。3.混合发酵液采前处理对猕猴桃果实采后品质和保鲜的影响果实的采后品质与植物的健康程度息息相关,只有健康作物才能够产出高品质的果实。对植物病害的防治最终目的就是让农产品的产量和品质得到提升。因此,对采后品质的研究能够反映农艺措施在实际生产应用中的有效性。混合发酵液处理后,猕猴桃溃疡病的相对防效达到68.11%;叶片光和效率提高11.58%,防御相关酶SOD、POD、PAL活性具有不同程度的显著提高。在采后猕猴桃实验中,与对照组相比,混合发酵液处理后单果重平均增加27.69%,果实硬度提高2.15倍,SSC提高34.40%,可滴定酸含量提升,乙烯产量和呼吸速率下降,相关防御酶活性提升。采后实验表明,处理组果实失水率显著下降,采后病害发病率显著降低,防病效果达到72.2%。猕猴桃果实转录组实验结果表明,在采后果实抗病性方面,与抗氧化抗逆,生长素的运输有关的类黄酮合成途径中相关酶的转录水平上调最为显著,生长素、细胞分裂素、赤霉素和水杨酸等植物激素信号转导相关基因的转录水平同样提升显著,多种抗病蛋白基因表达水平上调,有效提高了果实抗病能力。在果实抑制成熟方面,混合发酵液处理后生长素相关基因(AUX/IAA)上调表达及其显著;显著促进了果实中丙氨酸解氨酶(PAL)过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因的表达。同时抑制了贮藏后期猕猴桃果实中多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶、β-葡萄糖苷酶、β-1,3-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶等多个细胞壁水解酶基因的表达。果实成熟相关转录因子RIN4、CNR6表达量显著降低;乙烯合成相关途径中,两个最重要的限速酶ACS3和ACO表达量极显著下调,乙烯信号转导途径中的负调控因子CTR1、EIN3和EIN4表达量极显著上调。实验结果证明了混合发酵液采前处理可以通过抑制细胞壁降解过程和乙烯合成转导途径中的相关基因表达,从而达到延缓猕猴桃果实成熟的结果。代谢组学实验结果表明,采后果实植物激素含量发生改变,生长素、水杨酸含量上升,脱落酸含量下降,多种氨基酸、维生素和类黄酮物质含量上升。这些结果在基因水平证明混合发酵液促进了果实的发育,提升果实品质,延长果实保鲜期。综上所述,黑根霉和拟康氏木霉混合发酵液可以提升土壤理化生性状,改善土壤微生物区系,有效抑制植物病原微生物生长,从而达到防治土传病害的目的。对猕猴桃的采后实验表明,混合发酵液采前处理有效提高了采后果实品质,延长果实储藏时间。本研究提供了一种防治植物病害,抗逆增产的生物防治新思路,对国家农药化肥增效减施策略和可持续农业的发展具有重大意义。