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植酸酶(EC.3.1.3.8)是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称,属于酸性磷酸酶的一个亚类,在饲料行业极具应用价值。人们为获得经济廉价的植酸酶用于动物饲料添加剂作出了很大的努力。目前已筛选得到许多产植酸酶的物种,包括植物、动物和微生物(特别是真菌和细菌)。
相对于已有的基因克隆策略,本实验构建了一种通过CODEHOP PCR和TAIL-PCR联用克隆植酸酶基因的方法。以Aspergillus niger和Aspergillus orzae的总RNA分别反转录获得其所表达基因的第一链cDNA。以第一链cDNAs为模板,克隆得到了包含Aspergillus niger和Aspergillus oryzae植酸酶全长基因以及部分5UTR和3UTR的序列。并设计引物扩增出Aspergillus niger、Aspergillus oryzae植酸酶蛋白成熟肽编码区(不含信号肽序列),在Pichia pastoris GS115中实现甲醇诱导的整合分泌表达。对表达的产物进行的性质分析显示,A.niger rPhyA和A。oryzae rPhyA这两个真菌植酸酶基因均属于组氨酸酸性磷酸酶家族。
在实验室水平上,毕赤酵母工程菌表达这两株植酸酶均实现了高效表达,在最适温度50℃,最适pH值5.5条件下,A.niger rPhyA和A.oryzae rPhyA的植酸酶活性分别达到680U/ml和400U/ml。针对工业生产中的实际问题,从构建的工程菌株里面选择酶活高、具有工业化生产前景的含有黑曲霉植酸酶基因的Pichia pastoris工程菌为实验对象进行摇瓶培养。根据相关报道培养基以麦芽作为主要原料,选取了麸皮、麦糠、鱼粉等廉价的农业下脚料作为氮源,从中筛选得到了适用于工业上发酵植酸酶的低成本原料麦糠。并优化了发酵条件,初步得到最适于发酵的条件麦糠添加量为10g/100g麦芽粉,甲醇浓度为2%,装液量1/10,摇床转速为250r/min,发酵时间为72h。