背景和目的 心脑血管病是威胁人类健康的主要疾病之一。动脉介入治疗如球囊扩张和支架置入已成为治疗冠心病及颈动脉狭窄有力对策。而20-50%的再狭窄严重影响了其远期效果。有研究提示再狭窄由多因素引起，但主要与血管重新塑造，血管平滑肌细胞从中层向内膜移行并过度增殖密切相关。血管平滑肌细胞增殖是再狭窄的关键病因。虽然有些药物和装置能降低再狭窄率，但结果并不十分满意。需要探索新的治疗方法来进一步降低或根治再狭窄。对球囊扩张损伤血管壁的转基因治疗展示了光明的前景，将外源DNA序列转染特定部位的血管壁细胞，使其在局部表达能较长时间产生有生物性和治疗作用的蛋白质。前列腺环素（PGI2），一种花生四稀酸代谢产物由血管壁产生，并与PGI2受体结合，产生cAMP而发挥多种作用如扩张血管、抑制平滑肌细胞增生，抗血小板聚集等作用。前列腺素合成酶（PCS）能催化前列腺素H2（PGH2）生成PGI2。牛的PCS cDNA已成功从主动脉内皮细胞克隆，其含有1500-bp开放读框编码—500—氨基酸多肽，分子量为56，628。Miyata等完成了人类从主动脉内皮细胞PCS cDNA克隆，其编码一个500—氨基酸多肽。相继大鼠和小鼠PCS cDNA被克隆，分别与人类PCS有84%和8%的一致性。对球囊扩张损伤的颈动脉进行PCS基因转基治疗再狭窄已成为可能，因此，我们构建了PCS表达质粒，检验内源性PGI2过度表达对新生内膜形成的抑制作用。本研究首先观察了PCS过度表达对培养的平滑肌细胞生长的抑制作用，再对家兔球囊扩张损伤的颈总动脉进行体内转染，以观察PCS基因转移对新生内膜的抑制作用。方法：第一部分1. PCS质粒DNA的制备：已知大鼠PCS序列（正向引物5—CATGTTCTGGGCCGCT—3，逆向引物5—GGAACAACAGGAAGT-CAGGAG—3，划线部分为启动密码子），由赛百盛公司提供引物。取大鼠主动脉平滑肌细胞用改良Chomczinski和 Sacchi方法进行细胞总RNA提取。用第一链cDNA合成设备对其进行逆转录。1.6Kb大鼠PCS cDNA<WP=77>被克隆于pCMV形成pCMV-PCS。用LacZ基因替代PCS基因构建pCMV-LacZ作为载体对照。用质粒纯化设备对pCMV-PCS 及pCMV-LacZ进行纯化。2. 取大鼠主动脉平滑肌细胞常规培养并用mouse anti-α-smooth muscle actin（1：200）对平滑肌细胞进行免疫组化染色鉴定。3 制备质粒DNA阳离子脂质体复合物形成并对体外培养的VSMCS的转染。4. 分组：共分9组，空白对照组、pCMV –Lacz、pCMV-PCS分别在10μmol花生四烯酸+10%胎牛血清、10%胎牛血清、无血清条件下孵育。5. 用10%SDS-聚丙稀凝胶对VSMCS溶解产物进行免疫印迹分析，用化学发光反应物(Amersham)显色。6. 用酶免疫测定设备（EIA）对cAMP进行测定。7. 采用BrdU标记技术对VSMCs增生进行评价。BrdU指数按下列公式计算：DAB染色阳性细胞/苏木精染色的所有细胞。8. 统计分析方法：多组比较采用方差分析，两两比较采用q检验，p<0.05为有显著性差异，结果用x±s表示。第二部分1. PCS基因体内转染 选雄性家兔为实验动物，兔龄3个月，体重1.2～1.5kg。用25%乌拉坦耳缘静脉注射麻醉。颈正中线性切口暴露并游离右颈总动脉（CCA）、右颈内动脉（ICA）和右颈外动脉（ECA）。在右CCA近ICA、ECA分叉处近心侧约2cm处及右ICA起始处用动脉瘤直夹临时夹闭，在右ECA暴露的远心侧，距动脉分叉处约1cm处结扎。自耳缘静脉注射肝素钠（200IU/Kg）5min，自右ECA结扎处近侧穿刺进入导丝，在穿刺点近侧束以牛皮筋以备止血。取出CCA动脉夹，继续进入导丝，取出穿刺针，取出时为防止穿刺点出血，拉紧牛皮筋，在导丝引导下将2.0mm直径球囊导管经ECA至CCA入主动脉弓，然后将气囊充气 。自主动脉弓向ECA后退，机械扩张右侧CCA，重复3次，每次30s，致右CCA内膜剥脱及机械损伤，撤出导管，束以牛皮筋止血。动脉夹原位夹闭CCA。 2．将实验动物分为4组：①空白对照组；②载体对照组注入pCMV-LacZ 40μg;③pCMV-PCS-5 组注入pCMV-PCS 5μg;④pCMV-PCS-40组注入pCMV-PCS 40μg。将100μl pCMV-PCS（5μg或40μg）或pCMV-LacZ脂质体复合物自ECA<WP=78>注入损伤CCA阶段，持续30min，然后拨出针头，结扎右ECA，去掉两端动脉夹，恢复血流，缝合创口，室温下标准混合饲料喂养。所有过程尽量在无菌环境下进行，术后青霉素20万U 肌肉注射1/d，连续3d。3．形态学分析 于基因转染后第15天杀死兔子，取出右颈总动脉，福尔马林固定，常规石蜡包埋，HE染色，用显微镜和计算机分析系统分别计算新生内层层与是中层平滑肌层平均厚度的比值（I/M）。中层平滑肌细胞层的平均厚度。4． 统计分析方法 采用方差分析和q检验。 结果：第一部分1. 在50μl 10%胎牛血清10μmol花生四稀酸培养情况下，pCMV-PCS转染的平滑肌细胞表达的PCS蛋白是pCMV-LacZ转染细胞的2.1倍（n=5 p<0.01）。2.在50μl 10%胎牛血清10μmol花生四稀酸培养情况下，空白对照组、pCMV – LacZ组及pCMV-PCS 组cAMP水平分别为6.8±0.7、7.5±0.4、17.3±0.5 pmol/mg蛋白（n=5 pCMV-PCS 转染组高pCMV-LacZ组2.3倍p<0.05 ，pCMV - LacZ对空白对照组无统计学意义）。3.在10%血清刺激下，pCMV-PCS组BrdU 指数明显低于pCMV - Lac