单宁酶也被称为单宁酰基水解酶,具有水解单宁类物质的作用。单宁酶在多种领域中均有巨大的应用前景,尤其是在饮料与制药工业中具有重要的应用价值。本文首先对固态生料发酵茶梗产单宁酶进行了探索。其次,利用惰性载体吸附茶梗浸提液模拟固态发酵生产单宁酶,研究其基本产酶规律并对组合碳氮源的添加量进行了优化。此后,利用羧基功能化磁性纳米粒子（CMNPs）固定化发酵所获得的单宁酶,并对影响酶固定化的因素以及所获得的固定化酶的物理性质进行了研究。最后,对固定化单宁酶的酶学性质进行了系统的研究。（1）采用固态熟料发酵与生料发酵方式获得单宁酶最高酶活力分别为13.4 U/gds和7.4 U/gds。在茶梗中单独添加单宁酸、无机盐和碳源对单宁酶的合成均没有促进作用,但单独添加无机氮源可显著提高单宁酶产量,无机盐和碳氮源同时添加对单宁酶的合成具有协同促进作用。无机氮源对单宁酶合成的促进作用均优于机氮源,最佳氮源为NH₄Cl。在NH₄Cl存在的前提下,添加一定量碳源对单宁酶合成均有促进作用,其中蔗糖为最佳碳源,但其在产酶初期对单宁酶的合成具有一定的抑制作用。同时添加7%的蔗糖和7%的NH₄Cl获得最高酶活力23.6 U/gds,是熟料发酵方式的3.2倍。（2）利用高密度的聚氨酯海绵吸附茶梗浸提液模拟固态发酵可获得单宁酶,且海绵重复使用5次仍不影响单宁酶合成。当发酵条件分别为海绵颗粒边长0.2 cm,茶梗浸提液含量95%,初始pH 4.0,接种量6.4×10⁷个孢子/g干基质,发酵温度30 ^oC,外加碳源单宁酸,外加氮源硫酸铵时,发酵时间96 h时,单宁酶活力获得最大值。而当发酵条件分别为海绵颗粒边长0.2 cm,茶梗浸提液含量90%,初始pH 5.0,接种量6.4×10⁷个孢子/g干基质,发酵温度30 ^oC,外加碳源单宁酸,外加氮源硫酸铵时,发酵时间96 h时,单宁酶细胞产率获得最大值。此外,试验结果还表明,添加葡萄糖和酵母浸膏对黑曲霉生物量的积累有显著促进作用,但酵母浸膏对单宁酶细胞产率具有明显的抑制作用。（3）经单因素试验确定碳源组合为葡萄糖和单宁酸,氮源组合为硫酸铵和酵母浸膏。采用响应面法优化组合碳氮源的添加量,当单宁酸、葡萄糖、硫酸铵以及酵母浸膏的添加量分别为7.49%、8.11%、9.26%和2.25%,其他条件为茶梗浸提液含量90%、不添加任何无机盐、培养基初始pH 5.0,接种量为6.4×10⁷个孢子/gds,30 ^o C条件下发酵96 h可获得最大单宁酶活力15.43 U/gds。优化条件下发酵120 h获得最大单宁酶活为19.22 U/gds,是优化前最大酶活力的6.36倍。（4）试验制备获得了粒径大小为10 nm左右的CMNPs,并成功的利用交联法固定化单宁酶获得Tannase-CMNPs。当固定化反应条件为戊二醛终浓度3.5%、游离单宁酶浓度1.75 U/mL、温度31 ^oC、转速220 rpm、pH 7.0,固定化时间26 h时,游离单宁酶具有较好的固定化效率。接着对获得的Tannase-CMNPs进行物理性质表征分析。傅立叶变换红外光谱分析（FTIR）和热重分析（TGA）结果显示单宁酶已成功固定在CMNPs表面。X射线衍射分析（XRD）结果显示固定化酶过程没有改变CMNPs的晶体结构,扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）结果显示CMNPs酶连聚集体Tannase-CMNPs呈层叠不规则状。振动磁强计分析（VSM）结果显示Tannase-CMNPs仍具有超顺磁性但饱和磁化值下降明显,仅为CMNPs的50%。Zeta电位分析结果显示在去离子水中Tannase-CMNPs Zeta电位为-36.0 mV,具有良好的稳定性。Tannase-CMNPs在去离子水中的平均粒径约为362 nm,粒径较CMNPs在同一条件下明显增大。（5）对所获得固定化酶与游离酶进行酶学性质分析。固定化单宁酶与游离单宁酶的最适反应温度均为50 ^oC,固定化酶与游离单宁酶的最适反应pH分别为6和7。与游离酶相比较,固定化酶的温度稳定性和pH稳定性以及存储稳定性均有一定程度的提高。Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺以及10 mM的Al³⁺均对固定化酶具有抑制作用。1 mM的Fe²⁺、5 mM的Mg²⁺以及10 mM的Mn²⁺对固定化酶酶活性具有强烈的促进作用。SDS、EDTA、尿素、吐温-80以及Triton X-100均对固定化酶活性产生一定程度的抑制,其中SDS对酶活抑制作用最为强烈。固定化单宁酶与游离酶的V_max分别为0.26μM·min^-1和0.12μM·min^-1固定化酶与游离酶的K_m值分别为0.29 mM和0.45 mM。固定化酶经6个循环的使用后剩余酶活为63.98%。