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第一章不同时间段肺纤维化中的病理变化及lyn的变化目的:研究不同时间段肺纤维化小鼠肺组织的病理变化及lyn蛋白表达的变化。实验方法:选取8周龄C57/b6J雄性小鼠24只,随机分为4组,每组6只,正常对照组用生理盐水0.5μl/g一次性气管内注射,模型组用BLM(博来霉素)5mg/kg一次性气管内注射,收集7、14、28天小鼠肺、肺泡灌洗液、血清,肺组织行HE染色,肺泡灌洗液行细胞计数及分类,血清行HYP(羟脯氨酸测定),检测0、14、28天小鼠肺功能,实时荧光定量pcr检测lyn、a-SMA、collagen I、mmp2、mmp9的表达。实验结果:(1)HE染色显示正常对照组小鼠肺泡间隔正常,无明显炎症细胞浸润,7天时小鼠II型肺泡上皮细胞增生,肺泡间隔增宽,可见少许炎细胞浸润;14天时小鼠肺纤维灶形成,大量炎细胞浸润,肺泡结构破坏明显;28天时小鼠肺异常重塑,肺泡塌陷。(2)小鼠血清HYP结果提示在14天时小鼠血清HYP值升至最高(P<0.01),此后有所降低(P<0.01)。(3)小鼠肺功能提示:小鼠潮气量、分钟潮气量、最大呼气量估计值、在50%潮气量的呼气流速、排斥反应指数随造模时间增加而逐渐降低,呼吸峰速度流、吸气结束时间造模时间增加逐渐增加。(4)实时定量PCR显示lyn、a-sma、collagen I、mmp2随着造模时间增加而逐渐递增,在28天时减少,而mmp9一直处于递增趋势(P<0.01)。结论:(1)小鼠肺纤维化中的胶原渗出及炎症细胞浸润在14天最明显(2)肺纤维化炎症细胞浸润初期以中性粒细胞浸润为主。(3)小鼠肺功能随造模时间增加而减弱。(4)lyn可能与肺纤维化程度呈正相关,mmp9升高可能加重肺功能恶化。第二章lyn过表达对肺纤维化的影响及其机制目的:探讨lyn过表达对肺纤维化的影响及其机制。实验方法:选取8周龄C57/b6J野生型及lyn+雄性小鼠各12只,lyn+小鼠随机分为两组,野生型小鼠随机分为两组,每组6只:野生对照组,lyn+对照组,野生模型组,lyn+模型组。正常对照组用生理盐水0.5μl/g生理盐水一次性气管内注射,模型组用BLM5mg/kg一次性气管内注射,收集小鼠肺、肺泡灌洗液、血清,肺行HE、masson染色,肺泡灌洗液行细胞计数及分类、Szapiel评分,血清作HYP(羟脯氨酸)测定,检测各组小鼠肺功能,肺组织行免疫荧光检测a-SMA、lyn、E-cadherin、avβ3表达,实时荧光定量pcr检测lyn、a-SMA、collagen I、mmp2、mmp9、avβ3、TFGβ1表达,TURNEL检测肺组织凋亡情况,Western blot检测a-SMA、collagen I、lyn、β-actin蛋白表达。实验结果:(1)HE、masson染色:lyn+模型组小鼠较野生型小鼠肺炎症细胞浸润、胶原渗出更重。(2)HYP:lyn+小鼠血清HYP比野生型小鼠组更高(P<0.01)。(3)肺泡灌洗液:Lyn+小鼠炎症细胞与野生型小鼠相比,其炎症细胞数目稍高(P<0.01)。(4)Szapiel评分:lyn+小鼠肺纤维化评分高于野生型肺纤维化小鼠(p<0.05)。(5)小鼠肺功能:lyn+模型组小鼠pifb、pefb、ef50、tr较野生型肺纤维化小鼠值更低,Tb较肺纤维化组更高。(6)免疫荧光:lyn+模型组小鼠a-SMA、avβ3蛋白的荧光强度比野生型小鼠模型组强度更高,而E-cadherin荧光强度则更弱(P<0.01)(7)实时荧光定量PCR:lyn+模型组小鼠较野生型模型组小鼠a-SMA、collagen I、mmp2、mmp9、avβ3、TGF-β1均明显增高(P<0.01)。(8)TURNEL染色法:lyn+模型组小鼠凋亡细胞较野生型模型组小鼠更多。(9)Western blot:lyn+小鼠模型a-SMA、collagen I表达高于野生型模型组(P<0.01)。结论:(1)lyn能促进肺纤维化发生发展;(2)lyn促进肺纤维化发生的机制可能是:1、激活avβ3促进肌成纤维细胞活化,趋化因子增加,引起炎症细胞浸润增加;2、促基底膜破坏加重进一步加重肺纤维化发生。