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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起以引起母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状为临床特征的接触性传染病，是影响全球养猪业最重要的疾病之一。我国于1996年首次分离出PRRSV，2006年爆发的由PRRSV变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合（HP-PRRS），给我国养殖业造成巨大损失，PRRS的防控成为猪场疫病防控的重点。疫苗接种作为防控PRRS的有效手段被广泛使用，种类主要有灭活疫苗和弱毒活疫苗两种，其中弱毒活疫苗因其具有较好的免疫保护效果而为多数猪场使用。目前我国投入使用的商品化PRRS弱毒活疫苗毒株主要有：经典PRRSV的CH-1R株，HP-PRRSV的JXA1-R、HuN4-F112和TJM株等，造成了我国猪场中多种毒株同时存在的复杂情况。而现有的疫苗鉴别诊断方法均无法从血清学上对疫苗免疫和野毒感染的猪进行区分，从而给疫病的防控和清除造成了巨大困难。针对此问题，本实验室利用反向遗传操作系统成功构建并获得了PRRS双标记基因工程弱毒疫苗株(在Nsp2编码区缺失25个氨基酸后在相同位置插入新城疫病毒NP49抗原优势区)，命名为rHN4-Δ25+NP49，并通过试验证明该疫苗株不仅具有较好的免疫保护效果，而且其内部具有独特的基因标记，为实现对该疫苗株的鉴别诊断及对PRRS的有效控制奠定了基础。为配合rHN4-Δ25+NP49疫苗株的使用，本实验从抗原和抗体两个角度出发，对其鉴别诊断方法开展以下研究：1、猪繁殖和呼吸综合征基因工程双标记疫苗RT-PCR鉴别诊断方法的建立参考GenBank上发表的PRRSV以及rHN4-Δ25+NP49的Nsp2编码区序列，在插入NP49区域两端保守区设计并合成一对引物，建立RT-PCR检测方法。用该方法对HP-PRRSV基因组、经典PRRSV基因组和rHN4-Δ25+NP49基因组时可以分别获得大小为234bp、321bp和306bp的片段。应用此方法对实验室保存的120份临床样品进行检测，结果显示PRRSV阳性样品65份，其中标记疫苗rHN4-Δ25+NP49样品39份，试验结果与掌握的血清背景符合。实验结果表明，该方法具有特异、敏感、简便的优点，可用于临床上鉴别rHN4-Δ25+NP49疫苗株、HP-PRRSV株和经典PRRS毒株。2、猪繁殖和呼吸综合征基因工程双标记疫苗ELISA鉴别诊断方法的建立围绕缺失的PRRSV Nsp2编码区25个氨基酸(25AA)和插入的新城疫病毒NP蛋白末端49个氨基酸（NP49）多肽为包被抗原，建立NP49-ELISA和25AA-ELISA鉴别诊断方法。通过NP49-ELISA和25AA-ELISA抗原包被浓度、抗体稀释度等系列检测条件的优化，结果显示， NP49和25AA多肽包被浓度均为500ng/孔，一抗稀释倍数均为1:40。使用建立的NP49-ELISA方法，对679份已知背景的疫苗免疫血清样品进行检测，与IDEXX公司商品化PRRS抗体检测试剂盒结果比较，结果显示两者的符合率为87.9%。同时用建立的25AA-ELISA方法对上述临床血清样品进行检测，结果与IDEXX公司商品化PRRS抗体检测结果比较，符合率为94.84%。对实验室保存的HuN4-F112疫苗免疫血清进行检测，结果显示，从免疫后第21天开始可检测到针对25AA的特异性抗体，持续到免疫后126天，与IDEXX公司商品化PRRS抗体检测结果相一致。通过本研究建立的RT-PCR鉴别诊断方法能够特异的从抗原角度对rHN4-Δ25+NP49标记疫苗候选株与其他PRRSV进行区分。NP49-ELISA和25AA-ELISA鉴别诊断方法简便、快速、特异，能够从血清学上区分PRRSV基因标记弱毒疫苗株（rHN4-Δ25+NP49株）免疫血清与自然感染血清。本研究为进一步完善rHN4-Δ25+NP49标记疫苗候选株鉴别诊断方法提供了重要的参考和实验数据。