论文部分内容阅读
子宫颈癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤之一。宫颈癌发生和发展过程复杂,虽然HPV持续感染是宫颈癌发病主要原因,但是并非所有的HPV感染患者一定会发展成为宫颈癌,提示HPV感染是宫颈癌发生的必要非充分条件。在宫颈癌发生、发展和转移过程中有很多基因和蛋白参与其中,并且其具体机制尚未完全阐明,所以寻找宫颈癌发生发展过程中特异性的蛋白质,可以为宫颈癌的诊治探寻新的靶点,提供新的诊治思路。iTRAQ是一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术,目前已广泛应用于多种肿瘤标记物的研究。本研究拟使用iTRAQ技术分析宫颈癌与正常宫颈组织进行差异蛋白表达差异的鉴定和定量分析,从差异蛋白质中搜寻与宫颈癌发生及发展密切相关的特异性蛋白质分子。对挑选出的蛋白质分子进行深入分析,明确其在宫颈癌发生和发展过程中的机制。因此,本课题从分以下三个部分进行研究。第一部分宫颈癌与正常宫颈组织的差异蛋白质组学研究目的:使用蛋白质组学方法筛选出宫颈癌与正常宫颈的差异蛋白,探寻有意义的潜在靶点。方法:(1)使用iTRAQ串联质谱技术,对宫颈癌和正常宫颈组织标本中的差异蛋白质进行鉴定和定量分析。(2)使用Westernblot对iTRAQ的结果进行验证。(3)使用GO-Analysis和Pathway-Analysis对iTRAQ筛选出的差异蛋白进行功能和涉及的信号通路分析。结果:(1)iTRAQ共搜索出3300个具有95%可信区间的非拓余蛋白。进一步,为减少假阳性的发生,我们使用宫颈癌和正常宫颈组织表达差异大于1.3倍作为选择差异蛋白的标准,最终在宫颈癌和正常宫颈组织中筛选出了330个差异蛋白,其中包括137个上调蛋白和193个下调蛋白;(2)Westernblot结果显示:与正常宫颈组织相比,宫颈癌中LYZ,ORM1,LYN和STMN1的表达明显上调;与正常宫颈组织相比,宫颈癌中LUM,BGN和KRT4的表达明显下调。表明Westernblot结果与iTRAQ联合质谱方法得到的差异蛋白表达趋势一致。(3)GO-Analysis结果显示:上调差异基因的显著性功能结果包括基因表达、有丝分裂细胞周期和凋亡过程等;下调差异基因的显著性功能结果包括细胞外基质构建、内肽酶活性负性调节和肌肉收缩等。Pathway-Analysis结果显示:上调基因参与的显著性信号转导通路包括RNA运输、剪接、DNA复制、NF-kappaB等;下调基因参与的显著性信号转导通路包括粘附、补体系统、血管平滑肌收缩等。结论:(1)iTRAQ技术作为目前蛋白质组学研究的重要工具,也是研究宫颈癌特异性生物标记物性能可靠的工具和平台;(2)参与宫颈癌发生和发展过程的蛋白质及其复杂。第二部分LYN在宫颈癌中组织中的表达情况及与临床病理参数的相关性目的:检测宫颈癌,癌旁组织和正常宫颈组织中LYN的表达情况,探讨LYN的表达与宫颈癌临床病理参数之间的相关性。方法:(1)使用免疫组织化学检测宫颈癌组织芯片中LYN的表达情况;(2)统计学分析LYN的表达情况与宫颈癌临床病理参数之间的相关性。结果:(1)与癌旁组织和正常宫颈组织相比,宫颈癌组织中LYN的表达明显上调,并且随着肿瘤期别的进展,LYN的表达情况逐渐增强。(2)在宫颈癌组织中,LYN的高表达与宫颈癌FIGO分期和肿瘤分级呈正相关,差异有统计学意义。与宫颈癌患者年龄和肿瘤类型(鳞癌与腺鳞癌和腺癌之和相比,因只有一例腺癌标本,故没有单独比较)无明显相关性。结论:(1)LYN在宫颈癌中表达上调,起促癌基因作用;(2)LYN的表达与宫颈癌FIGO分期和肿瘤分级呈正相关,表明LYN在宫颈癌发生发展过程中起重要作用。第三部分LYN参与调节宫颈癌生物学行为及其相关机制的研究目的:探讨LYN在宫颈癌增殖、侵袭、迁移等生物学行为中的作用及其相关机制。方法:(1)Westernblot和RT-PCR检测不同宫颈癌细胞株中LYN的表达情况;(2)慢病毒沉默和过表达LYN的表达情况;(3)平板克隆形成实验和CCK-8实验检测沉默和过表达LYN后,宫颈癌细胞增殖能力变化情况;(4)Transwell迁移实验和划痕实验检测沉默和过表达LYN后,宫颈癌细胞迁移能力变化情况;(5)Transwell侵袭实验检测沉默和过表达LYN后,宫颈癌细胞侵袭能力变化情况;(6)鬼笔环肽标记细胞骨架检测沉默和过表达LYN后,宫颈癌细胞细胞骨架的变化情况;(7)CoIP检测LYN和p-STAT3的相互作用;(8)Westernblot检测沉默和过表达后IL-6/STAT3信号通路相关基因IL-6R,STAT3和p-STAT3的表达情况;(9)Westernblot检测IL-6作用于宫颈癌细胞最适浓度的测定;(10)Westernblot检测IL-6作用于宫颈癌细胞后IL-6R,STAT3和p-STAT3的表达情况;(11)裸鼠皮下成瘤检测沉默和过表达LYN后,对裸鼠皮下成瘤能力的影响;(12)免疫组化检测瘤体LYN和p-STAT3的表达情况。结果:(1)RT-PCR和Westernblot检测结果表明:宫颈癌HeLa、SiHa和C33a细胞株中SiHa细胞中LYN表达水平最高,C33a细胞中LYN表达水平最低,我们挑选SiHa细胞作为沉默实验的研究对象,C33a细胞作为过表达实验的研究对象;(2)GFP荧光、RT-PCR和Westernblot检测结果表明,沉默和过表达慢病毒可以有效的沉默和过表达LYN的表达。(3)平板克隆形成实验和CCK-8实验表明:沉默和过表达LYN的表达可以抑制和促进宫颈癌细胞细胞增殖能力。(4)Transwell迁移实验和划痕实验表明:沉默和过表达LYN的表达可以抑制和促进宫颈癌细胞细胞迁移能力。(5)Transwell侵袭实验表明,沉默和过表达LYN的表达可以抑制和促进宫颈癌细胞细胞侵袭能力。(6)鬼笔环肽标记宫颈癌细胞骨架实验表明:LYN可以影响宫颈癌的细胞骨架。(7)CoIP实验表明:p-STAT3与LYN在体内有相互作用。(8)Westernblot结果表明:沉默和过表达LYN可以通过IL-6/STAT3信号通路调节宫颈癌细胞生物学行为。(9)裸鼠皮下成瘤实验表明:沉默和过表达LYN在体内水平可以促进和抑制肿瘤生长。(10)免疫组化结果表明:与LV3-NC组相比,LV3-LYN组LYN和p-STAT3表达明显减弱;与LV5-NC组相比,LV5-LYN组LYN和p-STAT3表达明显增强。结论:(1)LYN可以调节宫颈癌增殖、侵袭和迁移等生物学行为;(2)LYN通过IL-6/STAT3信号通路,影响细胞骨架的方式调节宫颈癌细胞的侵袭和迁移。