论文部分内容阅读
目前全球大约有3.5亿乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)携带者,T细胞免疫在控制和清除HBV感染中发挥核心作用。然而,慢性乙肝(CHB)患者中,HBV特异性T细胞反应严重受损,导致长期免疫耐受,包括程序性细胞死亡受体(PD-1)和程序性细胞死亡配体(PD-L1)等共抑制分子的上调在内的几种机制共同导致HBV特异性T细胞的耐受和枯竭。因此,阐明CHB患者体内肝细胞表面PD-L1的表达机制和PD-L1在T细胞反应中的作用,将有利于揭示抗病毒T细胞耐受机制,为设计更有效的乙肝治疗性疫苗提供依据。啮齿动物模型和临床数据均表明从肿瘤中纯化的热休克蛋白gp96或其与病毒抗原形成的复合物能够诱导抗肿瘤效应或激发具有抗肿瘤和抗病毒的抗原特异的体液免疫和CD8+T细胞(CTL)反应。Gp96与一系列的Toll样受体(TLRs)相互作用激活天然免疫,并且通过抗原呈递激活T细胞从而介导获得性免疫。然而,gp96介导的天然免疫如何影响其活化T细胞功能并不清楚。 本研究主要内容包括:⑴分别构建与TLR2/4结合位点突变和缺失的两种突变体:gp96-mut和gp96-△CBD。通过免疫共沉淀(CoIP)、流式细胞术、Western blot、real-time PCR和免疫荧光实验检测gp96蛋白与TLR2/4的结合能力。结果证明gp96-wt能够与TLR2/4特异性结合,而gp96突变体(gp96-mut和gp96-△CBD)失去了与细胞表面TLR2/4结合的能力。同时通过B3Z T细胞激活实验发现突变型的gp96蛋白具有与野生型gp96蛋白同等的抗原呈递能力。⑵分析TLR结合区对gp96诱导的特异性T细胞反应的作用。用gp96-wt-或gp96-mut-HBc87-95肽复合物分别免疫BALB/c小鼠三次。通过HBc87-95 Ag tetramer、CD8和IFN-γ染色、CD4和IFN-γ染色、ELISPOT、杀伤实验分析HBV特异性T细胞反应。结果发现,gp96与TLRs互作的缺失导致特异性T细胞反应显著性降低,这表明gp96和TLRs的相互作用以及对TLRs的激活在gp96诱导的抗原特异性T细胞反应中发挥重要作用。在小鼠B16黑色素瘤模型中,与免疫野生型的gp96相比,gp96-mut-B16 Ag免疫组小鼠失去了抑制肿痛生长的功能,表明gp96抗肿瘤活性部分依赖于其与TLRs之间的相互作用。⑶通过免疫组化检测CHB患者体内PD-L1的表达情况,并分析其与患者预后的相关性。发现CHB患者体内PD-L1的表达明显上调,与病毒载量和肝细胞浸润情况密切相关。在转染和病毒感染实验中,均观察到HBV上调PD-L1的表达。在体外通过CHIP,EMSA,real-time PCR和双荧光实验鉴定PD-L1表达的关键转录因子。在体外和小鼠实验中,证实Stat1是HBx引起PD-L1上调的关键转录因子。最后,在HBV转基因鼠中,将以gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗与抗PD-L1单抗联用研究其抗病毒作用。用单抗阻断PD-L1/PD-1相互作用极大地增强了gp96介导的HBV特异性T细胞反应,并促进HBV转基因鼠中对HBV的清除,这为进一步优化gp96乙肝治疗性疫苗的抗病毒功能提供依据。