【摘 要】
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ε-聚赖氨酸（ε-PL）是由25~35个L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的一种均聚氨基酸,具有抑菌性广、热稳定好以及安全性高等优点,在欧洲中亚等地区作为食品防腐剂和药物载体广泛应用。我国ε-PL研究时间短,未能实现千吨级工业化生产,因此选育ε-PL高产菌株,实现低成本、高效率的工业化发酵生产,对我国的食品行业具有极其重要的意义。本研究以ε-PL产生菌S.albulus AM为出发菌
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ε-聚赖氨酸（ε-PL）是由25~35个L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的一种均聚氨基酸,具有抑菌性广、热稳定好以及安全性高等优点,在欧洲中亚等地区作为食品防腐剂和药物载体广泛应用。我国ε-PL研究时间短,未能实现千吨级工业化生产,因此选育ε-PL高产菌株,实现低成本、高效率的工业化发酵生产,对我国的食品行业具有极其重要的意义。本研究以ε-PL产生菌S.albulus AM为出发菌株,建立24深孔板培养代替摇瓶发酵筛选体系;通过核糖体工程三轮改造以及原生质体融合技术提高菌株ε-PL合成能力;对高产菌株进行形态学研究、基因分析及发酵性能检测,建立一种有效的育种手段。具体研究内容如下:1.核糖体工程选育ε-PL高产突变株。通过对菌株24深孔板培养和摇瓶发酵数据分析,发现两者间存在显著性（P=0.022＜0.05）。从四种抗生素中确定链霉素（Str）、庆大霉素（Gen）和遗传霉素（G418）作为出发菌株选育有效抗生素,其中单倍MIC链霉素正突变率最高（33%）,单倍MIC庆大霉素对菌株ε-PL合成能力提升效果最强（36%）。通过第二轮改造,发现“链霉素+庆大霉素”双重抗性正突变率较高（17%）,ε-PL产量达到（1.16 g/L）。在双重抗性的基础上,通过多倍抗性突变株的选育,最终得到高Str抗性株S-53（1.41 g/L）和高Gen抗性株G-154（1.58 g/L）,ε-PL产量是出发菌株AM的2.01倍和2.26倍。2.原生质体融合选育ε-PL高产融合子。以高Str抗性突变株S-53和高Gen抗性突变株G-154为亲本菌株。S-53的原生质体最佳制备条件为:培养32 h、溶菌酶浓度5 mg/m L、酶解时间90 min、酶解温度32℃;灭活条件为:60℃处理50 min;紫外（20 W,10 cm）照射100 min;G-154的原生质体最佳制备条件为:培养24 h、溶菌酶浓度7 mg/m L、酶解时间120 min、酶解温度32℃;灭活条件为:60℃处理60 min;紫外（20 W,10 cm）照射100 min。促融剂PEG 6000的最适作用浓度为40%。通过“双亲灭活法原生质体融合”和“原生质体融合结合抗性筛选”两种选育手段,共挑选8种不同于原始菌株的菌落形态,并筛选到一株ε-PL摇瓶产量2.51 g/L的高产菌株SG-162,较亲本菌株ε-PL摇瓶产量分别提升了78%和58%,是出发菌株AM的3.58倍。3.高产菌株形态学研究及基因分析。以高产菌株SG-162与AM为研究对象,对比两菌株在菌落形态、孢子生长分化、突变位点及指纹图谱等方面的差异,发现SG-162的菌落形态与出发菌株存在显著不同,且孢子生长速度及孢子化能力减弱;在摇瓶发酵过程中,SG-162能维持致密且均匀的菌丝球形态;SG-162的rps L基因存在位点特异性替换突变,即S12蛋白第34位碱基G突变为T。通过BOX-PCR指纹图谱对比,高产菌株SG-162缺失一段500 bp左右的基因片段。4.高产菌株SG-162发酵性能研究。通过6种发酵培养基中ε-PL含量测定,得出优化培养基为最适培养基,发酵96 h产量达到2.51 g/L;高产菌株SG-162两阶段补料-分批发酵发酵168 h后,ε-PL最终产量达到33.2 g/L,菌体干重41.3 g/L,菌体单位合成能力达到0.8 g/g。
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