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1目的阐明 lncRNAECONEXIN（简称 lnc ECONEXIN）/miR-26b-5p/TLR4 信号轴介导肝实质细胞焦亡,促进肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）活化,从而导致肝纤维化（liverfibrosis,LF）发生、发展的分子学机制及疏肝健脾方（shuganjianpi prescription,S GJPF）的干预作用。2方法2.1实验一:lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴介导肝实质细胞焦亡促进肝星状细胞活化的机制研究通过背部皮下注射四氯化碳的方法复制肝纤维化小鼠模型,HE、Masson和透射电镜等方法观察肝纤维化小鼠肝组织病理学特征;分离原代肝实质细胞与HSC,糖原染色和荧光染色鉴定肝实质细胞和HSC;核质分离和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验检测 lnc ECONEXIN 的亚细胞定位;构建lnc ECONEXIN过表达质粒和小干扰RNA,转染至肝实质细胞中,细胞计数试剂盒 8（cell counting kit-8,CCK8）和流式细胞术（flow cytometry）检测 HSC 细胞增殖及细胞周期的变化,实时定量PCR法（real time quantitative PCR,RT-qPCR）、免疫蛋白印迹法（Western blot,WB）和免疫荧光法检测α-SMA、Collagen I、caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88、NLRP3 以及 lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4 信号轴的表达,相关性分析验证lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴与HSC活化指标的相关性,双荧光素酶报告实验及系列回复性实验验证lnc ECONEXIN、miR-26b-5p和TLR4之间的靶向调控关系及对HSC功能表型的影响。2.2实验二:疏肝健脾方调控lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴减少肝实质细胞焦亡抑制肝星状细胞活化的机制研究制备SGJPF含药血清并筛选最佳含药血清浓度和作用时间;观察SGJPF最佳含药血清作用最佳时间后,对HSC细胞增殖、细胞周期、α-SMA、Collagen I、caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88、NLRP3 以及 lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴的影响;通过回复实验,在转染lnc ECONEXIN过表达质粒的基础上,给予SGJPF最佳浓度含药血清作用最佳时间后,观察HSC细胞增殖、细胞周期和活化标志物的变化。2.3实验三:疏肝健脾方调控lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴对肝纤维化小鼠发挥保护作用的机制研究复制化学性肝纤维化小鼠模型,灌胃给予SGJPF,观察SGJPF对小鼠肝脏病理组织学、α-SMA、CollagenI、caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88、NLRP3 以及 lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4 信号轴的影响。3结果3.1实验一:lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴介导肝实质细胞焦亡促进肝星状细胞活化的机制研究3.1.1肝脏病理组织检测LF模型组小鼠肝脏肝细胞受损,肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱,有明显胶原纤维沉积,表明LF模型建立成功。3.1.2原代细胞鉴定肝实质细胞呈多面体形,细胞核大而圆,PAS糖原染色与AFP染色均呈阳性;HSC呈梭形或多边形,具有胞突与邻近的星状细胞相连接,Desmin染色呈阳性。3.1.3 lnc ECONEXIN 表达及定位lnc ECONEXIN在LF肝脏组织和肝实质细胞中均高表达,且主要分布在细胞质中。3.1.4 lnc ECONEXIN 的转染效率lnc ECONEXIN小干扰RNA为siRNA1,浓度为100 pmol,干预时间为48h时,lnc ECONEXIN干扰效率最高;lnc ECONEXIN过表达质粒浓度为4 μg时,lnc ECONEXIN过表达效率最高。3.1.5 lnc ECONEXIN过表达/干扰状态对HSC细胞增殖、细胞周期及α-SMA和Collagen I表达的影响lnc ECONEXIN过表达后,HSC细胞活力升高,G1期细胞数降低,HSC活化指标α-SMA和Collagen I表达升高;lnc ECONEXIN干扰后,HSC细胞活力降低,G1期细胞数增加,HSC活化指标α-SMA和Collagen I表达降低。相关性分析结果显示,lnc ECONEXIN与α-SMA和Collagen I呈显著正相关。3.1.6 lnc ECONEXIN过表达/干扰状态对肝实质细胞焦亡的影响透射电镜观察显示,LF模型组肝实质细胞中出现大量焦亡小体,lnc ECONEXIN过表达后肝实质细胞中焦亡小体进一步增多,lnc ECONEXIN干扰后肝实质细胞中焦亡小体有所减少。不仅如此,lnc ECONEXIN过表达后,caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88 和 NLRP3 表达显著升高;lnc ECONEXIN 干扰后,肝实质细胞中caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88和NLRP3表达均显著降低。3.1.7 lnc ECONEXIN 过表达/干扰状态对 lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4 信号轴的影响相关性分析结果显示,lnc ECONEXIN与miR-26b-5p呈显著负相关,与TLR4呈显著正相关,miR-26b-5p与TLR4呈显著负相关。进一步验证发现,miR-26b-5p在LF肝脏组织和肝实质细胞中均低表达,lnc ECONEXIN过表达后,miR-26b-5p表达进一步降低,而lnc ECONEXIN干扰后,miR-26b-5p表达升高;TLR4在LF肝脏组织和肝实质细胞中均高表达,lnc ECONEXIN过表达后,TLR4表达升高,而lnc ECONEXIN干扰后,TLR4表达降低。3.1.8 lnc ECONEXIN、miR-26b-5p、TLR4 调控关系的验证生物信息学分析表明,lnc ECONEXIN与miR-26b-5p存在结合位点,miR-26b-5p与TLR4存在结合位点;双荧光素酶报告实验结果显示,在lnc ECONEXIN-WT和TLR4-WT组中,miR-26b-5p mimics 显著降低了荧光素酶活性,在lnc ECONEXIN-Mut和TLR4-Mut组中,荧光素酶活性无显著变化;不仅如此,在TLR4-WT组中,miR-26b-5p mimics进一步升高了 lnc ECONEXIN过表达后的荧光素酶活性,降低了 lnc ECONEXIN干扰后的荧光素酶活性,表明lnc ECONEXIN可通过竞争性结合miR-26b-5p上调TLR4的表达。3.1.9回复实验miR-26b-5p mimics 可降低 lnc ECONEXIN 过表达状态下 lnc ECONEXIN 水平,升高miR-26b-5p表达,抑制HSC细胞活力,增加G1期HSC细胞数量;TLR4抑制剂可升高miR-26b-5p抑制状态下miR-26b-5p水平,降低TLR4水平,抑制HSC细胞活力,增加G1期HSC细胞数量;TLR4抑制剂可降低lnc ECONEXIN过表达状态下lnc ECONEXIN水平,升高miR-26b-5p水平,抑制HSC细胞活力,增加G1期HSC细胞数量,表明lnc ECONEXIN可通过竞争性结合miR-26b-5p上调TLR4的表达,进而影响HSC的功能。3.2实验二:疏肝健脾方调控lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴减少肝实质细胞焦亡抑制肝星状细胞活化的机制研究3.2.1 SGJPF最佳含药血清的筛选SGJPF含药血清浓度为10%,作用时间为48h时,对HSC细胞活力的抑制作用最佳。3.2.2 SGJPF含药血清对HSC细胞增殖、细胞周期及α-SMA和Collagen I表达的影响与LF模型组相比,SGJPF含药血清显著降低了 HSC细胞活力,增加了 G1期HSC细胞数量,抑制了 HSC中α-SMA和Collagen I的表达。3.2.3 SGJPF含药血清对肝实质细胞焦亡的影响透射电镜显示,LF模型组肝实质细胞中出现大量焦亡小体,SGJPF含药血清干预后肝实质细胞中焦亡小体明显减少。不仅如此,SGJPF含药血清干预后,肝实质细胞中caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88和NLRP3表达均显著降低。3.2.4 SGJPF 对肝实质细胞 lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4 信号轴的影响SGJPF干预后,肝实质细胞中lnc ECONEXIN和TLR4表达均显著降低,miR-26b-5p表达显著升高。3.25回复实验SGJPF含药血清可抑制lnc ECONEXIN过表达状态下HSC细胞增殖活力,增加G1期HSC细胞数量,降低HSC中α-SMA和Collagen I的表达。3.3实验三:疏肝健脾方调控lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴对肝纤维化小鼠发挥保护作用的机制研究3.3.1 SGJPF对LF小鼠肝脏病理组织学的影响LF模型组小鼠肝脏肝细胞变性受损,肝小叶结构模糊,肝细胞索排列紊乱,有明显胶原纤维沉积,给予SGJPF不同剂量后,能改善小鼠肝脏受损状态,减少胶原纤维沉积。3.3.2 SGJPF对LF小鼠肝脏组织中α-SMA和Collagen I表达的影响与LF模型组相比,SGJPF不同剂量均显著降低了 LF小鼠肝脏组织中HSC活化标志物α-SMA和Collagen I的表达。3.3.3 SGJPF对LF小鼠肝脏组织中肝实质细胞焦亡的影响与LF模型组相比,SGJPF不同剂量可显著降低LF小鼠肝脏组织中caspase-1、IL-1β、IL-18、MyD88 和 NLRP3 的表达。3.3.4 SGJPF对LF小鼠肝脏组织中lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴的影响SGJPF干预后,小鼠肝脏组织中lnc ECONEXIN和TLR4表达显著降低,miR-26b-5p表达明显升高。4结论（1）lnc ECONEXIN可作为ceRNA竞争性结合miR-26b-5p,上调TLR4的表达,介导肝实质细胞焦亡,诱导HSC活化,促进LF的发生发展。（2）SGJPF可调控lnc ECONEXIN/miR-26b-5p/TLR4信号轴,减少肝实质细胞焦亡,抑制HSC活化,从而对肝纤维化发挥保护作用。