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在工业中应用最广泛的异氰酸盐是甲苯二异氰酸盐(Toluene Diisocyana,TDI),是引起职业性哮喘最常见的原因。暴露TDI环境的工人,约有5%-15%发展为哮喘,明显高于普通人群,且诱发的哮喘经常发展为重症哮喘。TDI哮喘的病理和临床表现基本上与过敏性哮喘相同,但针对TDI哮喘的发病机制研究还比较局限,很多环节尚不清,对其机制尤其是启动机制的了解是对TDI哮喘能够达到很好地诊断和治疗的关键步骤。目前的研究提示TDI诱发哮喘的主要作用环节有两个:其一是支气管上皮细胞作为主要靶细胞,TDI对支气管上皮细胞的作用,可能导致细胞结构的失常和生物活性因子的释放,在TDI哮喘中扮演重要角色;其二是气道粘膜下的抗原提呈细胞(如树突状细胞),TDI与体内形成的大分子如TDI-HSA渗透到粘膜下组织被抗原提呈细胞提呈后产生活性物质,这些活性物质与支气管上皮细胞产生的细胞因子一同活化淋巴细胞(包括Th1和Th2)、中性粒细胞等炎症细胞,从而引起下游一系列炎症反应。最近Lee等研究表明血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)在TDI哮喘扮演关键角色,但TDI是否可直接作用于人支气管上皮细胞(Humanbronchious epithelial cell,HBE)致VEGF表达增加,进而起动和促发气道炎症,引起气道高反应性的作用,尚不清楚。TDI-HSA等大分子抗原必须穿透支气管上皮细胞为主组成的粘膜屏障才可作用于抗原提呈细胞,然而工业环境中允许的低浓度TDI是不会直接引起上皮细胞损害,TDI是否通过影响HBE通透性导致哮喘气道炎症的发生发展还有待于进一部阐明。所以本课题从两个不同方面研究TDI对HBE的作用来初步探讨TDI哮喘发病机制。课题第一部分:甲苯二异氰酸盐(TDI)对人支气管上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响方法:1)制备TDI抗原结合物:应用改良的Son M方法制备TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。2)观察不同浓度的TDI-HSA和HSA对正常人支气管上皮细胞株HBE135-E6E7细胞活力影响:观察TDI-HSA对细胞活力影响时分为:对照组(不加TDI-HSA只以无血清培养基孵育),20μg/mlTDI-HSA组,40μg/mlTDI-HSA组,60μg/mlTDI-HSA组,80μg/mlTDI-HSA组,100μg/mlTDI-HSA组(n=7);观察HSA对细胞活力影响时分为:对照组(不加HSA只以无血清培养基孵育HBE135-E6E7组),20μg/mlHSA组,40μg/mlHSA组,60μg/mlHSA组,80μg/mlHSA组,100μg/mlHSA组(n=8)。按上述分组刺激HBE135-E6E7 48小时后,用四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力。3)观察不同浓度TDI-HSA对HBE135-E6E7 VEGF基因的影响:实验分成9组:对照组(不加HSA及TDI-HSA只以无血清培养基孵育),10μg/mlHSA组,20μg/mlHSA组,30μg/mlHSA组,40μg/mlHSA组,10μg/mlTDI-HSA组,20μg/mlTDI-HSA组,30μg/ml TDI-HSA组,40μg/ml TDI-HSA组(n=4)。按上述分组刺激HBE135-E6E7 12小时后,提取细胞总RNA,应用半定量RT-PCR方法检测HBE135-E6E7 VEGFmRNA。4)观察地塞米松对TDI-HSA诱导HBE135-E6E7 VEGF表达的影响:实验分为4组:对照组(不加HSA及TDI-HSA只以无血清培养基孵育),40μg/ml HSA组,40μg/ml TDI-HSA组,(40μg/ml TDI-HSA+1umol/L地塞米松)组,按上述分组刺激HBE135-E6E7 12小时后,提取细胞总RNA,应用半定量RT-PCR方法检测HBE135-E6E7 VEGF mRNA(n=4);刺激HBE135-E6E7 24小时后,用双抗体夹心ELISA检测各组上清液VEGF蛋白浓度(n=7)。5)采用SPSS11.5统计软件处理,计量资料用均数士标准差((?)±S)表示,不同组间用One Way ANOVA进行单变量方差分析,多重比较采用LSD法。结果:1) MTT比色法检测不同浓度的TDI-HSA和HSA对HBE135-E6E7活力结果:在TDI-HSA浓度分别为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml组对HBE135-E6E7细胞活力无显著影响,100μg/ml则可显著降低细胞活力(P<0.001):HSA组:20μg/ml和40μg/ml组对HBE135-E6E7细胞活力无显著影响),当浓度增至60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml则增加细胞活力(P均<0.05)。2) RT-PCR法检测不同浓度TDI-HSA对HBE135-E6E7 VEGF基因的影响结果:HBE135-E6E7组成性表达VEGF189、VEGFl65亚型基因,以VEGF165表达量较多。HBE135-E6E7 VEGF189基因和VEGF165基因在10μg/mlTDI-HSA组与10μg/ml HSA组以及对照组相比表达增加,但无显著差异(P均>0.05),在20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的TDI-HSA组与相应浓度的HSA组以及对照组相比,两亚型基因均表达显著增加(P均<0.05),且随着TDI-HSA浓度的增加表达亦随之增加(P均<0.05);两亚型基因在不同浓度HSA组之间表达无显著差异(P均>0.05),各浓度HSA组与对照组比较亦无显著差异(P均>0.05)。3) RT-PCR、双抗体夹心ELISA法检测地塞米松对TDI-HSA诱导HBE135-E6E7VEGF表达的影响结果:HBE135-E6E7 VEGF189基因和VEGFl65基因在TDI-HSA组与对照组以及HSA组比较均显著增加(P均<0.001),(TDI-HSA+地塞米松)组与TDI-HSA组比较无显著差异(P>0.05);上清VEGF蛋白浓度在TDI-HSA纽与对照组以及HSA组比较增加3倍以上(P均<0.001),(TDI-HSA+地塞米松)组与TDI-HSA组比较无显著差异(P>0.05),对照组与HSA组上清VEGF浓度比较无显著差异(P>0.05)。结论:TDI-HSA在不影响细胞活力情况下以40μg/ml浓度时对HBE VEGF基因表达影响最大,并具有浓度依赖性。TDI在基因和蛋白水平上均可显著上调HBEVEGF的表达,且不能被地塞米松所抑制。课题第二部分:甲苯二异氰酸盐(TDI)对人支气管上皮细胞间通透性的影响及机制探讨方法:分组:对照组(不加HSA及TDI-HSA只以无血清培养基孵育),40μg/mlHSA组,40μg/ml TDI-HSA组,(40μg/ml TDI-HSA+0.02μg/mlVEGF)中和抗体组;按上述分组刺激HBE135-E6E7细胞24小时后,用FITC-右旋糖酐检测细胞间通透性(n=6),用透视电镜观察细胞间间隙(n=3)。结果:1) FITC-右旋糖酐检测TDI-HSA对HBE135-E6E7细胞间通透性的影响及VEGF通路在其中的介导作用:细胞间通透性在TDI-HSA组与对照组以及HSA组比较增加2倍以上(P均<0.001),在(TDI-HSA+VEGF中和抗体)组与TDI-HSA组比较有所下降(P<0.001),(TDI-HSA+VEGF中和抗体)组与对照组以及HSA组比较亦有显著差异(P均<0.001),对照组与HSA组细胞间通透性比较无显著差异(P>0.05)。2)透视电镜观察TDI-HSA对HBE135-E6E7细胞间间隙及VEGF及VEGF通路在其中的介导作用:TDI-HSA组可见细胞间局部连接疏松,紧密连接变少,见明显空隙,(TDI-HSA+VEGF中和抗体)组仍可见细胞间局部连接疏松,见明显空隙,对照组和HSA组的细胞间连接紧密,未见明显孔隙。结论:TDI明显增加HBE间的通透性,加入VEGF中和抗体可部分逆转TDI引起的HBE间通透性增加,TDI可能通过破坏支气管上皮细胞的紧密连接导致通透性的增加,而VEGF中和抗体不能逆转其紧密连接的改变。