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生命早期是肠道微生物群正确建立的关键时期,肠道菌群的早期定植又直接影响着婴儿免疫系统的发育和成熟,进而对机体健康产生短期,中期甚至是长期的影响。在这一生命阶段,母婴垂直传播在新生儿肠道微生物初始定植中发挥关键作用,而在众多传播途径中:羊水、阴道、空腔、皮肤、母乳等,尤以母乳喂养最为主要。乳酸菌,作为人体肠道菌群中一类重要的益生菌,与宿主的健康密切相关:某些特定的菌株已被证明具有免疫调节、缓解氧化应激、抑制炎症性肠病等功能,并且有报道认为:机体和肠道微生物之间具有特异性的相互选择关系:当菌株的来源和其应用到对象保持一致时,就会显著增强菌株对机体益生功能的特异性和有效性,即:最理想的益生菌最好是来源于人体本身。本研究采集纯母乳喂养婴儿新鲜粪便,从中分离出一系列乳酸菌株,并以抗人工消化液能力、耐胆盐能力、黏附能力等为指标,筛选出一株具有潜在益生功能的乳酸菌,通过对其16S rRNA进行测序并结合生理生化试验结果初步确定为植物乳杆菌,命名BF15,同时通过体外试验对该菌株的安全性(抗生素敏感性、有害代谢产物、溶血性等)及益生功能(免疫调节、抗氧化能力)进行了初步评估;进一步分析了该菌株在小鼠肠道中的定植能力及体内免疫调节功能;最后以DSS诱导小鼠UC为模型,从调节免疫、缓解氧化应激、平衡肠道菌群等方面对其缓解UC的功能进行较为全面的评价,并通过蛋白质组学揭示其干预炎症性肠病的作用机制。研究内容如下:1.采用Hungate厌氧培养技术对纯母乳喂养婴儿粪便中的乳酸菌进行分离,并以鼠李糖乳杆菌GG为阳性对照菌株,以耐酸、耐胆盐、耐受模拟人体消化液、黏附能力等生物特性为指标筛选具有潜在益生特性的菌株,通过生理生化试验结合16S rRNA测序鉴定菌株,进一步通过体外试验对所筛选菌株的安全性(有害代谢产物、药敏性、溶血性)及益生功能(体外免疫调节和抗氧化能力)进行初步评价。结果表明:经过各项指标的测定,筛选出一株益生性能表现良好(人工胃肠液高耐受性、体外高黏附性)的菌株,经生理生化试验和16S rRNA测序鉴定确定该菌株为植物乳杆菌,命名为BF15;体外安全性试验表明BF15除具有对氨基糖苷类、糖肽类抗生素的固有耐药性外,对苯唑西林、头孢噻吩也具有耐药性,但该菌株中不存在抗性质粒,并且不产生生物胺、亚硝酸盐和哚类有害代谢产物,且不具有溶血性,因而具备一定的安全性;体外益生功能评价结果表明一方面BF15的活性/热致死菌在一定的菌浓范围内(1×106~107CFU/mL)均能在体外促进小鼠淋巴细胞增殖,并且在相同菌浓条件下,与LGG体外免疫调节能力没有显著性差异(P>0.05),另一方面BF15能够耐受高浓度的H2O2(3.5 mmol/L),而且有较强的自由基(O2-·、·OH和DPPH)清除和抗脂质过氧化能力。2.应用基于rpo B基因的PCR-DGGE分子技术分析菌株在小鼠肠道内的定植情况;同时以环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制为模型,以LGG为阳性对照菌株,通过测定脏器指数、脾淋巴细胞转化值、血清溶血素水平、足趾肿胀度和巨噬细胞吞噬指数等各项免疫指标,分析肠道菌群多样性,对BF15保护小鼠免受环磷酰胺诱发的免疫抑制及肠道菌群紊乱能力进行评估。结果表明:BF15在停止灌胃后的第14 d仍可在小鼠粪便中检测到,具有较强的定植能力;同时BF15的早期灌胃可以明显抵制CTX诱发的小鼠免疫相关指标(脏器指数、脾淋巴细胞转化值、血清溶血素水平、足趾肿胀度及巨噬细胞吞噬指数等各项免疫)降低(P<0.01)及肠道菌群失调(Bacteroides相对丰度降低,Firmicutes及包含大量潜在致病菌的Proteobacteria的相对丰度升高;参与菌群各代谢通路的功能基因丰富度的失调:参与碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、聚糖生物合成和代谢等多各代谢通路的相对丰度显著减弱,参与细胞运动相关的代谢通路的相对丰度显著增强),具备一定的免疫调节能力。3.以葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎为模型,以LGG为阳性对照菌株,从调节免疫功能、缓解氧化应激、平衡肠道菌群等多角度评估BF15对溃疡性结肠炎的缓解作用,进一步通过结肠组织的蛋白质组学,从蛋白质水平揭示BF15干预溃疡性结肠炎的作用机理。结果表明:通过早期灌胃,菌株BF15通过减轻肠道黏膜损伤及炎症细胞浸润,缓解肠道黏膜氧化应激损伤(提高GSH-Px和SOD的活性,降低MDA的含量),提高能量代谢水平(提高超微量ATP酶活性),调节肠道黏膜免疫功能(抑制促炎因子(IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α),促进抑炎因子(IL-10及sIgA)的表达)能够有效缓解小鼠结肠炎症症状;同时BF15还缓解了由葡聚糖硫酸钠诱发的肠道菌群结构紊乱(Bacteroides和Actinobacteria相对丰度降低,Firmicutes、Proteobacteria、Verrucomicrobia 和 Tenericute 相对丰度提高,F/B(Firmicutes/Bacteroides)比值增大的紊乱趋势以及参与菌群各代谢通路的功能基因丰富度的失调:参与嘌呤、核糖体、氨基糖和核苷酸糖代谢、染色体等多个代谢通路的功能基因相对丰度减弱,而参与转运载体、ABC转运载体、双组分系统等相关代谢通路功能基因的相对丰度增强);最后通过对不同组别差异表达蛋白的生物信息学分析,揭示了益生菌(BF15/LGG)主要通过回调溃疡性结肠炎模型组中的差异蛋白(BF15主要回调 GSH-Px、pIgR、AR、ALOX15、MMP-2、ApoC-Ⅲ 等差异蛋白,LGG 主要回调 pIgR、ALOX15、ApoC-Ⅲ、TN、MMP-2等差异蛋白),使其趋向于正常的表达水平,进而调节抗原加工和抗原提呈系统对小鼠UC进行干预的作用机理。本论文研究成果将为丰富我国开发具有原创性的人源益生菌添砖加瓦,同时也为婴幼儿功能性食品提供优良的菌种资源。