论文部分内容阅读
Phaseolotoxin是一种来源于菜豆丁香假单胞菌的三肽类磷酸酰胺（phosphoramidate）天然产物,分子结构中存在三根氮磷键和N-P-N-S-O独特的杂原子结构。在过去的40年间,科研工作者们对其生物合成途径进行了广泛而深入的研究,并在产生菌株自我免疫机制和肽键形成等方面取得了一定的进展,但是催化其中氮磷键合成的相关酶以及反应过程仍未揭示。本文主要集中于对生物合成基因簇中磺酸基团代谢相关的两个基因（pht A,pht S）和一个磷酸丙酮酸二激酶（Pyruvate,phosphate dikinase,PPDK）同源蛋白（PhtL）进行研究,试图阐明Phaseolotoxin分子中氮磷键的生物合成过程。Phaseolotoxin结构中存在氨基磺酸（sulfamate）基团。而磺酸基团通常来源于3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸（3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate,PAPS）。PAPS是由环境中的硫酸盐转化而来的腺苷5’-磷酰硫酸（Adenosine 5′-phosphosulfate,APS）,经APS激酶的作用,3位羟基发生磷酸化而产生。APS可以在APS腺苷酰基转移酶（Adenylylsulfate-ammonia adenylyltransferase,APSAT）的催化下,磺酸基团氨解形成磷酸酰胺。在Phaseolotoxin生物合成基因簇中,存在两个磺酸基团代谢相关基因（pht A:编码磺酸基团转移酶,pht S:编码APS激酶）。本研究通过同源双交换介导的基因敲除方法,对其分别敲除。对?pht A和?pht S突变菌株进行发酵和高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）检测,结果显示?pht A不再产生Phaseolotoxin,同时也没有新的含磷中间体出现,而?pht S产生Phaseolotoxin的量有所下降。生物信息学分析表明,基因簇外存在着一段pht S同源片段aps K（locus tag PSPPH＿4132的部分片段）,pht S和aps K双敲除菌株不再产生Phaseolotoxin,结果表明APSK能够部分替代Pht S在Phaseolotoxin生物合成种的作用,这一功能与氮磷键合成相关。通过质谱母离子扫描分析和31P NMR（核磁共振）分析,没有在?pht J,?pht K,?pht L,?pht A,?pht S,?pht D等突变株发现含有磷原子的Phaseolotoxin生物合成中间体。于是尝试在Phaseolotoxin生物合成相关的蛋白质上进行寻找,基因簇中的pht L编码PPDK同源蛋白,而PPDK与磷代谢相关,因此pht L成为了重点关注的对象。I-TASSER预测的PhtL蛋白质结构预测表明,其主要由三个功能域组成:ATP结合功能域,磷酸受体结合功能域和His功能域。His600位于His功能域,这与同源序列比对找到的PPDK家族蛋白的结构特征一致。在结构比对中发现,PhtL的ATP结合功能域、His功能域与典型的PPDK对应结构相似,但是底物结合功能域存在较大差异。通过定点诱变实验获得的PhtL H600A和S449A的突变菌株,发酵不再产生Phaseolotoxin,H600A的结果与上述序列比对和结构分析相吻合。Ser449位于磷酸受体结合功能域,突变结果表明该氨基酸残基可能与磷酸受体结合有关。在?pht L突变株中超量表达带有His（6）标签的PhtL,通过亲和层析纯化His（6）-PhtL蛋白,进行酶解和质谱检测,在PhtL的594-606肽段（氨基酸序列为SSSLLCHLAILLR）的His600位检测到了两种修饰基团:焦磷酸修饰后β磷酸的1个羟基被替换为氨基,焦磷酸修饰后β磷酸的2个羟基被替换为氨基。结合磺酸基团研究,推测PhtL在反应过程中,His600形成焦磷酸修饰,随后Pht A催化PAPS转移磺酸基团至β磷酸上,经氨解形成氮磷键,全部氮磷键合成后转移至活化的鸟氨酸,产生PSOrn(（Nδ-（N’-Sulfodiaminophosphinyl）-L-ornithine）寻找生物合成中间体的一个关键点是提高其产量便于发现和分离,这也是本课题组一直研究的重点。在比较蔗糖基本培养基和葡萄糖基本培养基时,后者野生型发酵产物中Phaseolotoxin产量较前者低,同时在磷谱图中17.5 ppm位置出现了一个新的磷化学信号,该信号在Phaseolotoxin生物合成基因簇缺失菌株?pht的发酵产物中依然存在。采用数据依赖性采集质谱模式试图获得其结构信息,并找到了一个质核比为498.1179的候选分子。对Phaseolotoxin产生菌株Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola 1448A的基因组序列进行分析,发现一个跨度17Kb的基因簇,除了脒基转移酶和两个ATP Grasp酶编码基因,Phaseolotoxin合成基因簇中的其他基因均能在其中找到同源性极高的对应片段。该基因簇编码产物未知,质核比为498.117的新的含磷天然产物很可能来源于该序列。