论文部分内容阅读
柑橘的周期性冻害在世界范围内时有发生,造成了巨大的经济损失。采用转基因技术将抗寒基因导入柑橘栽培品种中表达是缩短育种周期,快速获得柑橘抗寒品种的有效途径之一。但是目前有关柑橘抗寒基因克隆的研究很少,这种情况严重限制了柑橘抗寒分子育种的进展。本研究从柑橘的抗寒近缘种枳(Poncirus trifoliata (L.) Raf.)中克隆出了柑橘冷响应基因表达调控途径中的3个关键基因PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2,同时对它们进行了详细的生物信息学分析,研究了它们在不同环境胁迫下在枳中的时空表达模式。通过转基因技术鉴定了其中一个编码上游转录因子的基因PtrICE1的功能,证明了在模式植物烟草中超量表达PtrICE1能够提高转基因烟草的抗寒性。然后克隆出了PtrICE1的上游启动子序列,并且通过转基因技术初步证明该启动子具有一定的冷响应和机械损伤响应活性。本研究为最终通过转基因技术获得抗寒性强的柑橘栽培品种提供了新的基因资源和理论基础。本研究获得的主要结果如下：1.从枳中克隆出了一个bHLH (basic Helix-Loop-Helix)家族基因PtrICE1,该基因长1933 bp,包含一个1464 bp的开放阅读框(ORF),编码487个氨基酸,蛋白质分子量为53.6 kDa,等电点为5.30。PtrICE1蛋白与其它植物ICE1家族蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且具有保守的SUMO (small ubiquitin-related modifier)结合结构域、bHLH结构域和C-末端区域。系统进化树的分析结果表明,植物ICE1家族蛋白可分为双子叶植物类和单子叶植物类两大类,PtrICE1属于双子叶植物类。2.在正常的生长条件下,PtrICE1在枳根、茎、叶中都有一定程度的表达。冷处理之后,枳叶和茎中PtrICE1表达先上调后下调,在根中表达先下调后上调。ABA处理之后,枳叶、茎、根中PtrICE1表达都是先上调后下调。这些结果说明冷处理和ABA处理都能影响枳不同器官中PtrICE1的表达。3.构建了PtrICE1的超量表达载体pMVICE1,并通过根癌农杆菌介导的叶盘法将pMVICE1导入模式植物烟草中,使PtrICE1在烟草中超量表达。通过PCR检测获得了17个阳性T0代转基因烟草植株。T0代转基因烟草的生长速度比野生型烟草慢,开花时间比野生型烟草推迟10d左右,开花以后两者的表型差异不大。4.T0代转基因烟草果实成熟后收集种子,经Km抗性筛选后获得阳性T1代转基因烟草。通过比较T1代转基因和野生型烟草在冷处理后的相对电导率、成活率以及表型后发现,与野生型烟草相比,T1代转基因烟草的相对电导率更低,成活率更高,并且常温处理之后能够恢复生长,说明转基因烟草的抗寒性比野生型更强,因此我们认为在植物中超量表达PtrICE1能够提高植物的抗寒性。5.本研究克隆出了PtrICE1基因的DNA序列。通过比较PtrICE1编码区的DNA和cDNA序列发现,PtrICE1含有四个外显子和三个内含子。采用pMD18-T载体介导的接头PCR方法克隆了PtrICE1基因的上游启动子序列,并采用PLACE程序对PtrICE1启动子上可能存在的顺式作用元件进行了分析,结果找到一些与植物抗逆性相关的顺式作用元件,其中包括冷响应元件(CRT/DRE、MYC)、光响应元件(GT1、GATA)、脱水和ABA响应元件(ABRE、MYB)和各种激素响应元件(ARF、ASF、GARE、WBOX等)。6.本研究构建了能够检测PtrICE1启动子活性的表达载体pBIPROICE1:GUS.通过根癌农杆菌介导的叶盘法将pBIPROICE1:GUS导入模式植物烟草中,并通过PCR检测获得了阳性的To代转基因烟草。To代转基因烟草叶片的GUS组织化学染色结果表明,野生型烟草叶片未出现蓝色斑点,而未经冷处理时转基因烟草叶片表面只出现了少量的蓝色斑点,但在叶片切口处染色较深。4℃冷处理之后,转基因烟草叶片上蓝色斑点的数量增加,且在叶片伤口处染色较深,说明PtrICE1启动子具有冷响应和机械损伤响应活性。7.从枳中克隆出了PtrHOS1基因,该基因长3434 bp,包含一个2922 bp的开放阅读框,编码974个氨基酸,蛋白质分子量为110.2 kDa,等电点为5.55。PtrHOS1蛋白与其它植物HOS1类似蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且在PtrHOS1蛋白的N末端含有一个高度保守的环指结构域(RING finger domain)。植物HOS1类似蛋白可分为双子叶植物类和单子叶植物类两大类,PtrHOS1属于双子叶植物类。在正常的生长条件下,PtrHOS1在枳根、茎、叶中表达强烈,冷处理和ABA处理之后,在枳的根、茎、叶中PtrHOS1的表达都出现了暂时的下调,说明在枳的根、茎、叶中PtrHOS1的表达都受冷处理和ABA处理的下调调控。8.从枳中克隆出了PtrLOS2基因,该基因长1662 bp,包含一个1338 bp的开放阅读框,编码445个氨基酸,蛋白质分子量为47.79 kDa,等电点为5.54。PtrLOS2蛋白与拟南芥LOS2蛋白及其它植物烯醇酶的氨基酸序列一致性很高(超过86%),说明PtrLOS2很可能编码一种烯醇酶。PtrLOS2含有两个高度保守的结构域,它们分别是DNA结合结构域和转录抑制结构域。在正常的生长条件下,PtrLOS2在枳根、茎、叶中都有表达,枳根和茎中PtrLOS2的表达量要高于叶中。从总体上来说,经过冷处理后,枳叶片和茎中PtrLOS2的表达是先上调后下调,而在根中PtrLOS2的表达是下调的。ABA处理之后,枳叶片中PtrLOS2的表达总体上是上调的,而在茎和根中PtrLOS2的表达是先下调后再上调。这些结果说明冷处理和ABA处理都能影响枳不同器官中PtrLOS2的表达。