纳米科技快速发展,纳米材料相关产品不断开发和广泛应用。由于纳米银具有独特的物理、化学和生物学特性,因此被广泛应用于光学、卫生、保健、医学等领域,是目前商品化程度最高的纳米材料之一。纳米银产品的不断开发和应用,人体可能直接接触纳米银相关产品或者暴露于含纳米银的环境中,这可能对人体构成潜在威胁。体内研究显示纳米银可以通过不同的途径进入生物体,继而跨越生物屏障分布到不同的组织器官,对机体产生一定的毒作用。体内研究提示肝脏和肺脏可能是纳米银的蓄积和作用靶器官。体外细胞研究表明,纳米银可以引起多种细胞产生细胞毒性、遗传毒性、神经毒性和免疫毒性。目前,关于纳米银引起细胞毒性的作用机制还不是十分清楚,还有许多问题亟待解决。比如纳米银引起细胞毒作用与氧化应激关系,纳米银的毒作用是由纳米银粒子还是其释放的银离子引起。因此本研究选择靶器官肺脏、肝脏来源的两种细胞株作为研究对象,人肺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(HepG2)。通过一系列研究比较纳米银对两株细胞的毒效应,并探讨氧化应激与细胞毒作用关系,考察纳米银释放的银离子在细胞毒性中的作用,进一步研究其诱导细胞凋亡的分子机制。1、纳米银表征与体外稳定性研究：PVP包被纳米银经透射电子显微镜(TEM)观察,纳米银颗粒为球形,分散均匀,无团聚现象,平均粒径为23.44+4.92 nm。马尔文粒度分析仪测得使用不含血清的DMEM培养液分散的纳米银平均水合粒径为61.89 nm,而使用含10%胎牛血清DMEM培养液分散的纳米银平均水合粒径为51.58nm,表明纳米银颗粒在培养液中有团聚现象,血清有助于其分散。使用超纯水、PBS和生理盐水分散的纳米银在4℃、25℃和37℃孵育48 h内最大紫外吸收峰和水合粒径都没有改变,而使用DMEM培养液稀释的纳米银溶液在4℃条件下分散稳定,在25℃和37℃时出现明显团聚现象,表明不同分散液、时间和温度对纳米银体外分散都有影响。2、纳米银对A549和HepG2细胞毒性研究：20～640ng/mL纳米银染毒A549和HepG2细胞24、48 h后,两株细胞存活率均呈现时间和剂量依赖性下降；在相同染毒条件下,A549细胞存活率下降更加明显。20～160μg/mL纳米银染毒两株细胞24、48 h后可以引起细胞形态学改变,具体表现为：20、40 μg/mL剂量下细胞形态没有明显变化；80、160μg/mL剂量下细胞间距增加、细胞皱缩变圆、漂浮细胞增加、细胞内出现空泡。细胞凋亡率检测发现与对照组比较,染毒24 h后各剂量组A549细胞凋亡率变化无统计学意义,而各剂量组HepG2田胞凋亡率均增加；染毒48 h后,40-160μg/mL剂量组A549细胞和160 μg/mL剂量组HepG2细胞凋亡率均增加。使用5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞2 h后,与相应染毒时间的160μg/mL剂量组比较,两株细胞凋亡率均显著下降。以上研究表明纳米银可以引起两株细胞增殖抑制、形态学改变和凋亡率增加,这可能与细胞内活性氧增加相关。3、纳米银对A549和HepG2细胞氧化应激作用研究：脂质过氧化检测发现80、160μg/mL剂量组A549细胞内丙二醛(MDA)含量显著增加；而各剂量组HepG2细胞内MDA含量都没有显著增加。超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽(GSH)含量检测发现,纳米银染毒A549细胞24 h后,SOD活力没有明显改变,GSH含量上升；染毒48 h后,SOD活力和GSH含量在40～160 μg/mL剂量组下降。纳米银染毒HepG2细胞24、48h后,SOD活力和GSH含量都表现为上升。此外,纳米银染毒两株细胞48 h后,细胞内应激蛋白Hsp70和HO-1表达都增加。以上研究表明纳米银可以引起A549细胞发生更明显的脂质过氧化,这可能与两株细胞内不同的氧化应激反应相关。4、细胞摄取纳米银定量及其分布研究：通过电感耦合等离子体质谱检测细胞摄取的银含量,结果显示纳米银染毒两株细胞24、48 h后,细胞摄取银含量都呈现剂量依赖性增加,但没有时间依赖性。表现为低剂量时(20μg/mL) 24 h细胞摄取的银含量小于48 h；高剂量时(80、160Hg/mL) 24h细胞摄取的银含量大于48 h。通过超速离心加超滤法分离染毒液银离子和细胞内银离子发现,使用含10%胎牛血清的DMEM培养液分散的纳米银溶液在0h时,银离子含量呈剂量依赖性增加,其中160μg/mL染毒液银离子释放最多,约为37ng/mL;于37℃孵育24、48 h后,只有在160μg/mL染毒液能检测到微量银离子。细胞内银离子含量检测发现A549细胞内银离子含量呈现时间和剂量依赖性增加,而HepG2细胞只呈现剂量依赖性增加。硝酸银染毒两株细胞后发现相同银含量的硝酸银对两株细胞活力影响大于纳米银。经TEM检测发现,纳米银颗粒可以通过胞吞途径进入细胞,主要分布在A549细胞的细胞质和溶酶体中；在HepG2细胞的细胞质、细胞核和溶酶体中。研究表明两株细胞可以通过胞吞途径摄取银颗粒,并在细胞内释放银离子,进而引起细胞毒性。5、纳米银诱导A549口HepG2细胞凋亡机制研究：纳米银染毒A549和HepG2细胞48 h后,Western Blotting检测发现A549和HepG2细胞内Cytochrome C、AIF、Caspase3、 Caspase8 和 Caspase9蛋白表达水平均显著升高,Bcl-2/Bax的比值显著降低。结果表明纳米银诱导两株细胞凋亡涉及线粒体途径和死亡受体途径。综上所述,纳米银对A549和HepG2细胞具有一定的细胞毒性。两株细胞在40～160μg/mL浓度下48 h,A549细胞比HepG2细胞显示更明显的增殖抑制和凋亡。纳米银可以通过胞吞途径被细胞摄取,并在细胞内释放银离子,进而引起细胞毒作用。纳米银诱导两株细胞凋亡涉及线粒体途径和死亡受体途径。造成两株细胞毒性差异的原因可能是A549细胞摄取银颗粒在体内释放的银离子高于Hep G2细胞；纳米银引起A549细胞发生更强的氧化应激作用。本研究在细胞和分子水平初步探究了纳米银对A549和HepG2细胞毒作用机制及其差异原因,为纳米银的安全性评价以及应用提供毒理学资料。