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盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)普遍生于盐土或盐渍化土壤、湖滨、河岸和沿海地带,是典型的盐碱地指示植物。盐地碱蓬属于稀盐的真盐生植物,强大的稀盐能力使盐地碱蓬体内的盐分总含量大约是其周围环境含盐量的两倍,是继盐芥之后又一植物耐盐基因研究的重要模式材料,也是尚未探索的适合中度嗜盐菌(Moderately halophilic bacteria)生长的天然内环境。为了解东营滨海盐地碱蓬植株内生中度嗜盐菌的多样性,利用传统分离培养技术和分子生物学方法对样品中可培养中度嗜盐菌的多样性进行研究,并从分离获得的细菌中挑选了一株新菌种进行分类学研究,最后对分离获得的内生菌进行回接检验。本文具体结果如下:1.首次对盐地碱蓬的内生菌研究进行报道。从东营滨海盐地碱蓬植株中分离到了有形态差异的15株内生菌。其中14株革兰氏阴性菌的最适生长NaCl浓度均在3%～7% (w/v)之间,属于中度嗜盐菌。革兰氏阳性芽孢杆菌ST306的耐盐度能达到13%。对分离到的中度嗜盐菌进行生理生化试验,并扩增得到了它们的16S rRNA基因序列,提交到GenBank。其中有5株菌的16S rRNA基因序列与已知菌种的序列最高相似性低于98%,说明盐地碱蓬中潜藏着较多的新的微生物种类。使用MEGA 4.0构建基于16S rRNA基因序列的系统进化树。2.根据其生理生化特征、16S rRNA基因序列和系统发育分析,分离获得的15株内生菌可分为四个类群,涉及Halomonadaceae科的Chromohalobacter属、Kushneria属、Halomonas属以及Bacillaceae科的Bacillus属。类群I以菌株ST307为代表,包括菌株B02、B03和B04,它们的16S rRNA基因序列与Chromohalobacter israelensis模式菌株ATCC 43985T (AJ295144)的相似性最高仅有95%。类群II以菌株ST504为代表,包括菌株ST505、B01、D01、D02、D03和D04,共7株菌,是盐地碱蓬内生中度嗜盐菌中的优势类群,其16S rRNA基因序列与菌株Halomonas sp. KY-Sp2-1 (AB305229)或Kushneria marisflavi strain SW32 (AF251143)的相似性均达到98%以上。类群III以菌株ST303为代表,包括菌株ST305和ST501,它们的16S rRNA基因序列与一株Gammaproteobacteria亚门中尚无明确分类地位的耐盐固氮细菌Haererehalobacter sp. JG 11 (EU937754)的相似性达到99%,同时该类群菌株与Halomonadaceae科Halomonas salaria DSM 18044T (AM229316)的相似性为97%。类群IV包括菌株ST306,为实验所分离菌株中唯一的一株芽孢杆菌,其16S rRNA基因序列与已发表菌株的相似性为96%,很可能代表了Bacillus属的新种。研究结果揭示,盐地碱蓬中存在较为丰富的中度嗜盐菌多样性和系统发育多样性,并且潜藏着较多的新的微生物类群。各种水解酶类的分析表明,在本研究分离获得的15株菌中有3株产蛋白酶,14株产酯酶,8株产DNA酶,11株产半乳糖苷酶,14株产脲酶,为新型生物催化剂的研究提供了丰富多样的研究材料。3.对分离自东营滨海盐地碱蓬的中度嗜盐菌ST307T进行了多相分类研究。按照Halomonadaceae科提出新种的要求,对菌株ST307T的各项分类指标进行了鉴定。菌株ST307T好氧,运动,产橙-黄色色素。在NaCl浓度0.6%～20% (w/v)、5～45oC、pH 5～9可以生长。首次使用反相高效液相色谱测定色盐杆菌属的DNA G + C mol%含量。采用90%双蒸水10%甲醇为流动相,在Venusil MP C18柱(5μm, 4.6×250 mm)上用反相HPLC法来分析碱基组成,计算得出DNA G + C mol%含量为60.5%,在色盐杆菌属的范围内。基于16S rRNA基因序列的系统进化分析表明,与菌株ST307T相似性最高的是C.israelensis ATCC 43985T和Chromohalobacter marismortui GSP58。采用复性速率液相杂交法测得菌株ST307T和C.marismortui ATCC 17056T的DNA杂交率为28.1%。表型、基因型和系统进化分析结果显示菌株ST307T应该是隶属于Chromohalobacter属的新种,命名为Chromohalobacter tungyingensis sp.nov.。菌株ST307T (= CGMCC 1.8902 = DSM 22428)为模式菌株。通过对菌株ST307T的鉴定,建立了在本实验室条件下进行新种鉴定的方法和平台。4.对分离得到的菌株ST307T进行回接检验。供试盐地碱蓬发芽后开始浇灌稀释后的菌株ST307T菌液,使菌株ST307T侵染碱蓬植株。待植株长出4～5片真叶后,取茎和叶分离内生菌。分离得到一株内生菌,命名为Y01。经过测序,菌株Y01和ST307T的16S rRNA序列相似性是100%,使用筛选出的6条随机引物和选定的退火温度扩增二者的DNA得到的RAPD (random amplified polymorphic DNA)图谱完全一致。以上结果说明菌株Y01和ST307T是同一株菌,即菌株Y01就是回接到供试植株中的菌株ST307T,也证实了菌株ST307T就是盐地碱蓬的内生菌。