论文部分内容阅读
目的：
探讨神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)对钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(Camodulin-dependent Protein Kinase Ⅱ,CaMKII)的影响,使用CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93抑制CaMKⅡ酶活性,进一步探讨其在NPY诱导心肌细胞肥大效应中的作用。
方法与结果：
1.SD大鼠原代心肌细胞培养取新生1～3dSprague-Dawley乳鼠心室肌,剪碎后用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞,采用差速贴壁分离法,在37℃、5％CO2培养箱中孵育1.5-2h,将未贴壁的心肌细胞悬液接种于含20％血清的DMEM培养液中,加入终浓度为0.1mmol/L5-溴脱氧尿嘧啶以抑制非心肌纤维细胞的生长。心肌细胞在相差显微镜下可见自发性搏动60-100次/min。
2.NPY对心肌细胞CaMKⅡ信号途径的影响
2.1心肌细胞核钙离子浓度的变化选择状态良好的心肌细胞随机分为两组(n=6),对照组：培养液中不加任何刺激物；NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol/L的NPY。24h后,以Fluo-4 AM标记胞核游离钙,激光共聚焦显微镜记录心肌细胞静息状态下胞核钙离子浓度,NPY组胞核钙离子浓度明显高于对照组(P<0.01)。
2.2心肌细胞胞CaMKⅡδ蛋白表达选择状态良好的心肌细胞随机分为两组(n=3),NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol/L的NPY;对照组：培养液中不加任何刺激物。24h后,采用Western-blot法检测心肌细胞内CaMKIIδ蛋白表达。NPY组CaMKIIδ蛋白含量明显高于对照组(P<0.01)。
2.3心肌细胞P-CaMKII蛋白表达选择状态良好的心肌细胞随机分为5组(n=3),NPY0组、NPY5组、NPY10组、NPY15组和NPY30组,分别加入终浓度为100nmol/L的NPY刺激0min、5min、10min、15min、30min,采用Western-blot法检测P-CaMKII蛋白表达。NPY刺激后5min,P-CaMKII即有表达,15min达到高峰,然后开始下降。
2.4心肌细胞CaMKII酶活性测定选择状态良好的心肌细胞随机分为2组(n=4),对照组：不加任何刺激物；NPY15m组,加入终浓度为100nmol/L的NPY刺激15min。NPY刺激15min CaMKII活性较对照组明显升高(P<0.05)。
3.KN-93对NPY诱导的心肌细胞肥大效应及核钙浓度的影响
3.1心肌细胞3H-亮氨酸掺入量测定选择状态良好的心肌细胞随机分为5组(n=6),NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol/L的NPY;KN-931组、KN-935组和KN-9310组分别加入CaMKII特异性抑制剂KN-93,终浓度为1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L,同时加入终浓度为100nmol/L的NPY;对照组：培养液中不加任何刺激物。加药刺激24h后,用3H-亮氨酸掺入法检测心肌细胞蛋白质合成速率,NPY组心肌细胞3H-亮氨酸掺入量较对照组明显增高(P<0.01),说明NPY可以刺激心肌细胞蛋白合成速率的增加；而不同浓度的KN-93(1μmol/L,5μmol/L和10μmol/L)均明显减少NPY诱导的心肌细胞3H-Leu掺入量(P<0.05,0.01),并呈浓度依赖性。
3.2心肌细胞肥大基因ANF、β-MHC mRNA表达选择状态良好的心肌细胞随机分为3组(n=6),NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol/L的NPY;KN-93组：同时加入终浓度为10μmol/L的CaMKII特异性抑制剂KN-93与终浓度为100nmol/L的NPY：对照组：培养液中不加任何刺激物。加药刺激24h后,荧光定量PCR法检测心肌细胞ANF、β-MHC mRNA的表达。NPY组ANF、β-MHC mRNA表达明显高于对照组(P<0.01),而KN-93组明显抑制NPY诱导的心肌细胞ANF、β-MHC mRNA的表达(P<0.01)。
3.3 心肌细胞核钙离子浓度的变化选择状态良好的心肌细胞随机分为两组(n=6),NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol/L的NPY;KN-93组：培养液中加入终浓度为100nmol/L的NPY与终浓度为10μmol/L的KN-93。加药刺激24h后,以Fluo-4AM标记胞核游离钙,激光共聚焦显微镜记录心肌细胞静息状态下胞核钙离子浓度,KN-93组的胞核钙离子浓度明显低于NPY组(P<0.01)。
结论：
1.NPY可激活CaMKⅡ信号通路,表现为心肌细胞胞核钙浓度增加,CaMKⅡδ蛋白及p-CaMKⅡ蛋白表达上调,CaMKⅡ酶活性增强。
2.CaMKⅡ信号通路在NPY诱导的心肌细胞肥大中发挥着重要作用。LM-93可明显抑制NPY诱导的核钙浓度、心肌细胞蛋白合成以及肥大基因ANF与β-MHCmRNA表达增加,提示了CaMKⅡ可调控NPY诱导的心肌细胞肥大效应。