第1部分TFA异构体对人脐静脉内皮细胞生存及凋亡的影响目的：流行病学研究证实反式脂肪酸(Trans Fatty Acids, TFA)摄入可促进动脉粥样硬化性疾病的发生,而且不同来源TFA的致冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)风险不同,工业产TFA (Industrially Produced TFA, IP-TFA)的危害明显高于反刍动物源TFA (Ruminant TFA, R-TFA).由于不同来源TFA所含的异构体不同,提示不同的TFA异构体心血管生物学效应可能不同,但其机理目前不清。血管内皮的损害是动脉粥样硬化的始动机制,本部分研究重点观察五种TFA异构体在体外培养条件下对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)生存及凋亡的影响是否存在差异,以解释临床和流行病学研究结果的机理。方法：原代HUVEC细胞分为6组：正常对照组、T-C16：1组、Δ6T-C18：1组、△9T-C18：1组、△11T-C18：1组和T-C18：2组。正常对照组为普通培养基培养,其余五组分别用含相应TFA异构体培养基培养。分别以50umol/1、100umol/1、200umol/1、500umol/1浓度,观测第0、6、12、24小时HUVEC存活率和死亡率,以观察不同TFA异构体对HUVEC存活影响的时效和量效关系。在上述实验结果的基础上,选择采用200umol/1浓度作为最佳实验刺激条件,测定第0、6、12、24小时HUVEC存活率及凋亡率,并比较T-C16：1和其他四种18碳TFA异构体对HUVEC存活率及凋亡率的差异。结果：1、五种TFA异构体包括反式软油酸(T-C16：1)、反式油酸(△6T-C18:1、△9T-C18:1、△11T-C18:1)、反式亚油酸(T-C18：2)在50umol/1浓度时,HUVEC的存活率与正常对照组相比无差别,500umol/1浓度时15小时左右HUVEC几乎全部死亡。而200umol/1浓度导致的细胞损害比100umol/1浓度出现更早、且随时间变化的趋势更为明显。结果表明,五种TFA在一定浓度均降低HUVEC的存活率,并呈现时间和浓度依赖性规律。2.200umol/1浓度干预条件下,五种TFA异构体均明显降低HUVEC存活率。在12h时点,T-C18：2组存活率即明显低于T-C16：1组；在24h时点,Δ6T-C18：1、△9T-C18:1组存活率也明显低于T-C16：1组,然而△11T-C18：1组的存活率与T-C16：1组相似。与其它浓度比较,200umol/1浓度组存活率下降出现较早、且呈明显的时效关系,利于观察不同TFA异构体间的差异；而且200umol/1浓度更接近普通人群血浆中TFA的含量,因此定位为最佳的实验干预浓度。3.200umol/1浓度干预条件下,五种TFA异构体均明显增加HUVEC凋亡率,但各自的效应不同,由强到弱依次为T-C18:2.△6T-C18:1.△9T-C18:1、△11T-C18:1、T-C16:1。且T-C18:2、△6T-C18:1和Δ9T-C18：1组HUVEC凋亡率明显高于T-C16：1组,但Δ11T-C18：1与T-C16：1组间无明显差异性。结论：1、在体外培养条件下,T-C16：1、△6T-C18:1、△9T-C18:1、△11T-C18:1和T-C18：2均可通过增加凋亡的途径降低HUVEC的存活率,并且其危害呈现时效和量效关系。2、在200umol/1浓度干预下,以T-C16：1作为对照组,T-C18：2致HUVEC凋亡的效应最强、Δ6T-C18：1和△9T-C18:1次之、而△11T-C18：1最弱。证实同为18碳链的四种TFA异构体致HUVEC的凋亡效应存在明显差异性。3、四种18碳链的TFA异构体致HUVEC凋亡的程度存在显著差异,可以认为反式双键的数量和位置与其生物学效应有关。4、鉴于△9T-C18:1与T-C16：1的反式双键的位置相同,但它们的致细胞凋亡作用不同,提示碳链长度也是决定不同TFA诱导HUVEC凋亡差异的一个影响因素。第2部分TFA异构体对人脐静脉内皮细胞NOS-NO的影响目的：一氧化氮(Nitric Oxide,NO)不仅是体内强有力的舒血管分子,也是重要的抗动脉粥样硬化分子,适度的NO对维持血管系统的正常功能甚为重要。NOS-NO是体内重要的分泌NO的系统。TFA异构体对于HUVEC的NOS-NO系统的影响目前并不清楚。本部分研究主要观察：在体外培养条件下TFA异构体对血管内皮NOS-NO系统的影响是否存在差异性。方法：实验分组与第一部分相同,以200umol/1为TFA实验浓度,检测0、6、12、24小时HUVEC培养上清液中NO含量和总NOS活力变化；检测24小时HUVEC eNOS mRNA以及eNOS蛋白表达的变化。并以T-C16：1组作为对照,比较分析四种18碳链TFA异构体对上述参数的影响是否存在差异。同时采用两变量相关分析细胞培养上清液NO浓度与HUVEC凋亡率的关联。结果：1、与正常对照组和基础状态相比,五种TFA异构体均能降低HUVEC上清液NO浓度。在12h时点,T-C18：2组上清液NO浓度明显低于T-C16：1组；在24h时点,△6T-C18:1、△9T-C18:1和T-C18：2组的NO浓度均明显低于T-C16：1组,尤其是T-C18：2组；然而△11T-C18：1组的NO浓度一直与T-C16：1组相似。2、与正常对照组和基础状态相比,五种TFA异构体均能降低上清液总NOS活性。但组间出现显著差异的时间点比NO浓度变化的时间点更早,在6h时点,△6T-C18:1、△9T-C18:1和T-C18：2组总NOS活性明显低于T-C16：1组,而△11T-C18：1的总NOS活性也一直与T-C16：1组相似。3、细胞上清液NO浓度与HUVEC凋亡率呈负相关(r=-0.949,P<0.05)。4、与正常对照组比较,五种TFA异构体均能抑制eNOS的mRNA表达,T-C16：1组的NOS mRNA表达为正常对照组的32%、△11T-C18：1为23%、△6T-C18：1为13%、A9T-C18：1为8%、T-C18：2仅为3%。其中△6T-C18:1、△9T-C18:1和T-C18：2组的eNOS mRNA表达明显T-C16：1组,而△11T-C18：1组与T-C16：1组之间无统计学差别(18.55±0.05比19.06±0.07,P>0.05)。5、五种TFA异构体组eNOS蛋白表达量均明显低于正常对照组。与T-C16：1比较,T-C18:2、△6T-C18:1和A9T-C18：1组的eNOS蛋白表达量明显更低；而△11T-C18：1组与T-C16：1组eNOS蛋白表达量无统计学差异。结论：1、在体外培养状态下,T-C18：2、△6T-C18：1、△9T-C18:1、△11T-C18:1和T-C16：1均可降低HUVEC培养上清液NO浓度和总NOS活性,下调HUVEC的eNOS mRNA和蛋白表达。2、不同TFA异构体对于HUVEC的NOS-NO系统的抑制效应(降低NO浓度、NOS活性、下调eNOS mRNA和蛋白表达)具有差异性,T-C18：2的抑制作用最强、△6T-C18:1和△9T-C18:1次之,而△11T-C18:1与T-C16：1最弱。3、NO浓度和HUVEC凋亡率升高之间呈显著负相关,提示不同TFA异构体对于NOS-NO系统抑制程度的差异是它们致细胞凋亡差异的基础原因。第3部分TFA异构体对人脐静脉内皮细胞PRMT/ADMA/DDAH的影响目的：非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADM A)是机体内调节NOS-NO系统重要的物质,因为具有竞争性抑制NOS的作用,而被称为“内源性的NOS抑制剂”。甲基化蛋白转移酶Ⅰ (Protein Arginine Methyl Transferase Ⅰ, PRMT Ⅰ)是ADMA生成的主要限速酶,其活性高低与体内ADMA的生成密切相关。而体内90%以上的ADMA是经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase, DDAH)分解代谢的。因为三者之间存在密不可分的关联,故被称为PRMT-ADMA-DDAH系统。我们第一、二部分的研究已经发现,TFA异构体可明显抑制NOS-NO系统,然而深层的机制不明。因此我们提出假设：不同TFA异构体对PRMT-ADMA-DDAH系统具有不同的影响,进而造成对NOS-NO系统影响不同。本研究部分主要观察体外培养条件下,不同TFA异构体对血管内皮细胞的PRMT-ADMA-DDAH系统的影响是否存在差异性。方法：实验分组与第一部分相同,以200umol/l为TFA实验浓度,检测0、6、12、24小时HUVEC培养上清液中ADMA含量和DDAH活性；检测24小时HUVEC的PRMTⅠ、DDAH Ⅰ和DDAH Ⅱ mRNA以及蛋白表达的变化。并以T-C16：1组作为对照,比较分析四种18碳链TFA异构体对上述参数的影响是否存在差异。同时采用两变量相关分析细胞培养上清液DDAH活性与ADMA浓度及ADMA浓度与总NOS活性的关联。结果：1、与正常对照组和基础状态相比,五种TFA异构体均能升高HUVEC上清液ADMA浓度。在12h和24h时点,△6T-C18:1、△9T-C18:1和T-C18：2组上清液ADMA浓度明显高于T-C16：1组；但五种TFA异构体升高ADMA幅度不同,T-C18：2升高幅度最大；其次为△6T-C18:1和A9T-C18：1；而△11T-C18：1与T-C16：1作用最弱。2、与正常对照组和基础状态相比,五种TFA异构体均不同程度地降低上清液DDAH活性。细胞上清液DDAH活性与ADMA浓度呈负相关(r=-0.975,P<0.05)。ADMA浓度与总NOS活性也呈负相关(r=-0.918,P<0.05)。3、在五种TFA异构体干预各组,HUVEC的PRMTⅠmRNA及蛋白表达与正常对照组无明显差别。4、五种TFA异构体干预组,HUVEC的DDAH Ⅰ和DDAH Ⅱ mRNA和蛋白表达均明显低于正常对照组。五个TFA干预组间比较发现：△6T-C18:1、△9T-C18:1和T-C18：2组的DDAH Ⅰ和DDAH Ⅱ mRNA和蛋白表达明显低于T-C16：1组,而△11T-C18：1组与T-C16：1组无统计学差别。结论：1、在体外培养状态下,T-C18:2、△6T-C18:1、△9T-C18:1、△11T-C18:1和T-C16：1均可升高HUVEC培养上清液ADMA浓度,同时导致DDAH活性下降。ADMA浓度和DDAH活性下降之间呈负相关。2、由于五种TFA异构体均不影响ADMA的合成酶PRMTⅠ mRNA和蛋白表达。因此可以认为,培养上清液ADMA浓度增加不是源于ADMA合成增加。3、在体外培养状态下,五种TFA异构体均可下调DDAH Ⅰ和DDAH II mRNA和蛋白表达。因此可以认为,培养上清液ADMA浓度增加是源于ADMA分解减少。4、在体外培养的HUVEC,虽然不同TFA干预均能抑制PRMT-ADMA-DDAH系统中DDAH合成环节而使ADMA降解减少,但其程度有明显不同。T-C18：2的作用最强、Δ6T-C18：1和A9T-C18：1次之,而△11T-C18：1与T-C16：1最弱。