肝癌是一种在世界范围内发病率和死亡率都非常高的恶性肿瘤,由于进展快,转移、复发率高而使其病人治疗后5年生存率较低,如果能够阐明肝癌转移发生的分子机制并从分子水平对其转移进行早期干预,将会极大地改善肝癌病人的治疗效果。为了能够到达异位形成转移癌,肿瘤细胞必须完成一系列有序的选择性步骤,其中包括脱离原位癌,侵袭进入脉管系统,在脉管系统中存活,然后侵袭进入异位器官的基质层,长出脉管系统并增殖。转移过程中的肿瘤细胞必须克服在这一过程中所要面临的种种压力才能够最终到达异位形成转移灶。这些压力包括机体的免疫监视能力、体内的乏氧环境、各种抗肿瘤药物的攻击等。另外,肿瘤转移过程中还必须有多种效应分子的参与,其中很大一部分的mRNA和蛋白表达水平在低氧诱导下上调。乏氧被认为是肿瘤细胞在生存过程中必须要克服的一个因素,同时,有越来越多的证据显示乏氧能够促进肿瘤发展。本课题在成功建立了转移性肝癌细胞模型的基础上,对其有效性以及转移能力进行了验证,并从转移性肝癌细胞对各种刺激（包括外源性TRAIL、AKT/ERK通路抑制剂）的反应性来探讨其抵抗失巢凋亡的分子机制,然后进一步筛选并论证了抵抗失巢凋亡和抵抗低氧刺激的相关分子,为临床上判断肝癌预后以及靶向性治疗奠定坚实的理论基础和实验基础。目的:1.建立一种能够模拟转移过程中的肝癌细胞在脉管系统中存活状态的转移性肝癌细胞模型,并研究其聚集稳定性和转移能力。2.通过研究转移性肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的反应以及对抗肿瘤药物AKT/ERK通路抑制剂的反应来研究其抵抗失巢凋亡的分子机制。3.探讨转移性肝癌细胞对乏氧刺激的反应。4.筛选抵抗失巢凋亡和抵抗乏氧刺激相关的分子,以用于抗肿瘤转移的早期诊断、预防和治疗。方法1.转移性肝癌细胞模型的建立以及其聚集率和转移能力分析1.1.转移性肝癌细胞模型的建立BEL7402和SMMC7721肝癌细胞系以PRMI1640加10%胎牛血清为培养液,在37℃、5%CO₂条件下培养至对数生长期,用0.25%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液,以RPMI1640调整好浓度后,加入Poly-HEMA培养板中继续培养24 h,得到悬浮生长的转移性肝癌细胞模型。1.2.转移性肝癌细胞模型建立条件探索细胞培养至对数生长期并制备成单细胞悬液后,96孔板中接种不同细胞数量0.5×10⁴,1×10⁴,1.5×10⁴,3×10⁴,3×10⁴,前四个组细胞接种前Poly-HEMA培养板用无菌PBS洗3遍,第五组不洗涤,每组设六孔重复,继续培养24 h,用CCK-8和trypan blue染色检测细胞活性和死亡率。1.3.转移性肝癌细胞的聚集率在铺有Poly-HEMA的96孔板中培养悬浮生长的转移性肝癌细胞,24小时后计数孔中单个细胞数,然后依据如下公式计算聚集率:聚集率=1-培养24h后孔中单个细胞数╱接种细胞数×100%。1.4.Transwell检测转移性肝癌细胞的侵袭力和运动力取对数生长期肝癌细胞的单细胞悬液,调整细胞浓度为6×10⁵/mL,以500μL/孔接种于预铺有Poly-HEMA和没有预铺Poly-HEMA的24孔板各孔中,铺Poly-HEMA的为悬浮生长组,没有铺Poly-HEMA的为贴壁生长组,培养24小时后收细胞制成单细胞悬液,以含1%FBS的RPMI1640调整细胞浓度,1.5×10⁵/孔加入到预先铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室中,其下室中预先加有500μL含10%FBS的RPMI1640,于37℃培养20小时后,穿过小室膜至膜下的细胞经固定、染色后计数,最后将小室膜切下铺于载玻片上,树脂封片后镜下照相。转移性肝癌细胞的运动力实验与侵袭力实验不同之处在于Transwell小室不需要预先铺Matrigel基质胶,并且接种细胞后培养6小时进行固定、染色、计数及封片。2.转移性肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的反应及其机制探讨2.1.转移性肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的反应1).CCK-8、trypan blue染色检测TRAIL诱导的凋亡效应贴壁生长组和悬浮生长组各分为7组,分别加入终浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的TRAIL蛋白,继续培养24 h后,用CCK-8试剂盒和trypanblue染色检测TRAIL诱导转移性肝癌细胞的凋亡效应。贴壁生长组和悬浮生长组各分为7组,加入终浓度20ng/mL的TRAIL蛋白,继续培养0 h,2 h,5 h,8 h,12 h,24 h,48 h后,用CCK-8试剂盒和trypan blue染色检测TRAIL诱导转移性肝癌细胞的凋亡效应。2).TUNEL、Caspase-3活性检测分析TRAIL诱导的凋亡效应贴壁生长组和悬浮生长组细胞培养20 h左右时,实验组加入20ng/mL TRAIL,空白对照组加入等量的PBS。继续培养24 h后,消化、收集细胞（包括上清中漂浮的细胞）,洗涤,严格按照TUNEL试剂盒说明书操作,分析细胞的凋亡率;继续培养3 h,6 h,9 h,12 h和24 h后,收集细胞,用Caspase-3活性检测试剂盒测定不同时间点各组的Caspase-3活化程度。2.2.转移性肝癌细胞抵抗TRAIL诱导凋亡的机制探讨1).转移性肝癌细胞中TRAIL及其受体的表达情况Trizol一步法提取贴壁生长和悬浮生长细胞中的总RNA,表达谱芯片分析TRAIL及其受体mRNA的表达情况。并用RT-PCR检测转移性肝癌细胞中TRAIL及其受体在RNA水平的变化。用ELISA法检测培养上清中sTRAIL蛋白的分泌水平,FCM检测转移性肝癌细胞表面膜结合型TRAIL及其受体在蛋白水平的表达情况。2).转移性肝癌细胞中Caspase-8,-9,-3的活化情况Western blot检测转移性肝癌细胞及贴壁生长肝癌细胞中Caspase级联反应中Caspase-8,-9,-3前体的表达情况,计算其活化水平。3.转移性肝癌细胞对AKT/ERK通路抑制剂的反应贴壁生长组和悬浮生长组细胞培养20 h左右,分别加入PBS、1μM Wortmannin、50μM PD98059以及1μM Wortmannin和50μMPD98059,继续培养24 h后,用CCK-8试剂盒检测细胞生存状态;用trypan blue染色分析细胞死亡率;收集细胞抽提蛋白后,用Western blot方法检测AKT/ERK通路蛋白的活化水平。4.转移性肝癌细胞对hypoxia的反应取对数生长期单细胞悬液,接种为悬浮生长组和贴壁生长组各4组,其中两组分别在普通CO₂培养箱和乏氧培养箱中培养24 h后,进行CCK-8试剂盒检测和trypan blue染色。另两组先常规培养24 h后再置于乏氧条件下培养24 h,然后进行CCK-8试剂盒检测和trypan blue染色。CCK-8检测抑制率计算按如下公式:抑制率=A常氧-A乏氧╱A常氧。trypanblue染色按照如下公式计算死亡率:细胞死亡率=死细胞数╱死细胞数+活细胞数。5.抵抗失巢凋亡和乏氧刺激的相关分子筛选及论证5.1.转移性肝癌细胞表达谱芯片结果分析对贴壁和悬浮生长肝癌细胞做了表达谱芯片研究,利用Cluster软件对其差异表达基因进行聚类分析,找到参与抵抗失巢凋亡同时与乏氧刺激密切相关的差异表达基因。5.2.MicroRNA芯片结果分析对贴壁生长细胞、悬浮生长细胞以及乏氧状态下生长的细胞做了microRNA芯片研究,在http://www.targetscan.org/网站对其结果进行分析,查询其中上调和下调的microRNA参与调控的靶基因,将其与表达谱芯片中找到的差异基因进行比对,探寻在抵抗失巢凋亡和抵抗乏氧过程中起关键作用的基因的调控microRNA。5.3.反义封闭聚集成团细胞的方法学探讨通过四组方案反义封闭悬浮生长细胞,分别是反义寡核苷酸直接转染贴壁生长和悬浮生长细胞;脂质体介导反义寡核苷酸转染贴壁生长和悬浮生长细胞;脂质体介导反义寡核苷酸无血清条件下转染贴壁生长细胞6h后分组为贴壁生长组和悬浮生长组以及脂质体介导反义寡核苷酸有血清条件下转染贴壁生长细胞6h后分组为贴壁生长组和悬浮生长组。比较不同方案封闭效率及实验稳定性。5.4.反义封闭相关基因后细胞生物学活性检测挑选其中的ANGPTL4,CA9,NDRG1,TRAIL和TrkB,设计反义寡核苷酸序列,对悬浮生长组和贴壁生长组进行反义封闭,继续孵育24 h后,用RT-PCR检测封闭效率,用CCK-8试剂盒和trypan blue染色检测细胞生物学活性。6.统计学分析结果用mean±SD表示,各组之间差别的统计学意义用SPSS10软件中的T检验或者one-way ANOVA进行统计,P＜0.05被认为有统计学意义。结果1.转移性肝癌细胞模型的建立及其聚集稳定性和转移能力分析1.1.转移性肝癌细胞模型常规培养的BEL7402细胞和SMMC7721细胞在培养板内伸展开,长成单层细胞,而悬浮生长的细胞培养24 h后,细胞变圆并且聚集成团。悬浮生长24 h聚集率稳定,均大于99.7%。在制作转移性肝癌细胞模型过程中,预铺有Poly-HEMA的培养板如果不洗涤,则细胞死亡率大于90%;96孔板的细胞密度在3×10⁴时,细胞死亡率小于5%,低于3×10⁴的各个密度与该密度相比,细胞死亡率明显差别（p＜0.05）。1.2.转移性肝癌细胞的运动力和侵袭力贴壁生长细胞的运动力和悬浮生长细胞的运动力差别没有统计学意义。悬浮生长组与贴壁生长组具有侵袭力的细胞数分别为19473±1104和9110±706,差别有统计学意义（p＜0.05）。2.转移性肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的反应及其机制探讨2.1.转移性肝癌细胞抵抗TRAIL诱导的凋亡效应具有时间依赖性和剂量依赖性转移性肝癌细胞能够抵抗TRAIL诱导的凋亡效应,并且这种效应具有时间依赖性和剂量依赖性。其中,转移性肝癌细胞在20ng/mL TRAIL处理24 h后的凋亡率是20%,而对照组仅为5%。我们根据时间依赖性和剂量依赖性曲线确定后续实验的剂量为20ng/mL,处理时间为24 h。2.2.转移性肝癌细胞抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡转移性肝癌细胞经过TRAIL处理后,其TUNEL法检测到的细胞凋亡率为23.1%,明显低于对照组细胞的43.7%。两组细胞的Caspase-3活化水平均在TRAIL作用9 h时达到高峰,但是转移性肝癌细胞的Caspase-3活化水平在各时间点均低于对照组细胞,以9 h时差别最明显。2.3.转移性肝癌细胞中TRAIL mRNA水平的表达明显高于贴壁生长细胞基因芯片检测发现在抵抗失巢凋亡的悬浮生长细胞中TRAILmRNA的表达水平比贴壁生长细胞上调了3.9倍。RT-PCR检测发现转移性肝癌细胞中TRAIL mRNA的表达明显高于贴壁生长细胞。2.4.转移性肝癌细胞中TRAIL蛋白水平的表达存在不一致现象ELISA法检测发现转移性肝癌细胞培养上清中分泌的sTRAIL蛋白水平明显高于贴壁生长细胞,而FCM检测发现膜结合型TRAIL在转移性肝癌细胞表面表达低于正常生长的贴壁细胞。2.5.转移性肝癌细胞中TRAIL受体mRNA水平和蛋白水平的表达均明显低于贴壁生长细胞基因表达谱芯片和RT-PCR检测发现在抵抗失巢凋亡的悬浮生长BEL7402和SMMC7721肝癌细胞中TRAIL受体DR4、DR5、DcR1和DcR2在mRNA水平的表达比贴壁生长细胞低。FCM检测膜结合型TRAIL受体的表达发现转移性肝癌细胞表面的DR4、DR5、DcR1和DcR2表达均低于贴壁生长细胞。2.6.转移性肝癌细胞在TRAIL作用后Caspase级联反应各分子的活化水平明显低于贴壁生长细胞Western blot检测发现,经20ng/mL TRAIL处理后,贴壁生长肝癌细胞提取物中Caspase-8,-9,-3前体活化明显,而转移性肝癌细胞提取物中各前体的活化受抑制。3.转移性肝癌细胞对AKT/ERK通路抑制剂的反应3.1转移性肝癌细胞抵抗AKT/ERK通路抑制剂的能力更强显示贴壁生长的肝癌细胞在单独应用AKT/ERK通路抑制剂时,其生物学活性受抑制程度高于悬浮生长细胞,而细胞死亡率也高于悬浮生长细胞。而当联合应用两条通路抑制剂时,转移性肝癌细胞生物学活性较单独应用通路抑制剂显著降低,其降低的幅度明显高于贴壁生长细胞。3.2在转移性肝癌细胞AKT通路受到抑制时ERK蛋白能够被代偿性激活Western blot结果显示当AKT通路受抑制时,贴壁生长组细胞的ERK蛋白的相对磷酸化水平为0.67±0.006,而悬浮生长组为0.93±0.055,差别有统计学意义。4.转移性肝癌细胞对hypoxia的反应4.1单个悬浮生长细胞乏氧培养24小时细胞生长状态在肝癌细胞还没有获得抵抗失巢凋亡能力时将其置于乏氧条件下,则CCK-8和trypan blue染色结果提示失去附着的转移性肝癌细胞和正常附着生长的细胞间细胞活性及细胞死亡率差别不大。4.2聚集成团的悬浮生长细胞乏氧培养24小时的生长状态将已经获得抵抗失巢凋亡能力的转移性肝癌细胞和贴壁生长的肝癌细胞同时放入低氧环境中,则转移性肝癌细胞的活性明显高于贴壁生长细胞,死亡率明显低于贴壁生长细胞,提示转移性肝癌细胞抵抗低氧的能力明显高于贴壁生长的细胞。5.抵抗失巢凋亡和低氧刺激的相关分子筛选及论证5.1.表达谱芯片中参与抵抗失巢凋亡同时耐受低氧的基因表达谱芯片中在抵抗失巢凋亡过程中起作用同时耐受低氧的基因有许多,其中:ANGPTL4上调了16.29倍,BNIP3上调了7.88倍,CA9上调了10.31倍,IER3上调了7.95倍,IGFBP3上调了31.07倍,NDRG1上调了18.4倍。5.2.与乏氧和失巢相关的microRNA间存在交叉microRNA芯片结果显示,乏氧刺激下和失巢刺激下上调的microRNA重叠部分占到两种刺激下上调基因的44.4%,而下调的microRNA重叠部分有18.7%。5.3.表达谱芯片中差异表达基因与microRNA芯片中差异microRNA调控基因吻合良好表达谱芯片中差异表达基因与microRNA芯片中差异microRNA调控基因吻合良好,其中表达谱芯片结果中转移性肝癌细胞表达明显增高的BNIP3、CA9、NDRG1相对应的hsa-miR-558、hsa-miR-516a-3p/516b^*、hsa-miR-342、hsa-miR-620等在转移性肝癌细胞中显著下调。5.4.反义封闭悬浮生长细胞的方法学探讨PS-asODNs/ANGPTL4直接转染结果不稳定,脂质体介导转染悬浮生长细胞的转染效率低于转染贴壁生长细胞的转染效率,我们对培养至对数生长期的贴壁生长细胞进行反义封闭,6 h后分为贴壁生长组和悬浮生长组继续培养24 h,反义封闭效率基本一致。5.5.ANGPTL4反义封闭后细胞的生物学活性RT-PCR结果显示,PS-asODNs/ANGPTL4可显著降低ANGPTL4 mRNA的合成。反义封闭ANGPTL4后,转移性肝癌细胞与正常贴壁生长的肝癌细胞相比活性降低明显,其死亡率也较贴壁生长的肝癌细胞明显增高。结论1.转移性肝癌细胞模型的细胞聚集率在24小时稳定达到99.7%左右,进一步验证了模型的有效性。2.转移性肝癌细胞的侵袭能力明显高于贴壁生长细胞,提示抵抗失巢凋亡的转移性肝癌细胞具有更强的通过第三微环境进而侵入第二微环境的能力。3.转移性肝癌细胞一方面分泌更多的sTRAIL,另一方面自身能够抵抗TRAIL诱导的凋亡,通过诱导免疫效应细胞发生凋亡来逃逸机体免疫系统的监视,这一过程被称为“肿瘤反击”。转移性肝癌细胞表面的膜结合型DR4,DR5均明显下调,可能是转移性肝癌细胞能够抵抗TRAIL诱导凋亡的机制之一。4.当AKT或者ERK通路单独受抑制时,转移性肝癌细胞的活性并没有发生多大变化。但是,当两条通路同时受抑制时,产生了一个非常明显的细胞死亡率。说明在这两个信号传导通路之间存在很强的代偿作用。当其中的一条通路受抑制时,另外一条通路的活化被放大来代偿其生存信号的缺失。Western blot结果进一步显示抑制AKT通路后磷酸化ERK蛋白的水平明显提高。5.转移性肝癌细胞通过抵抗TRAIL诱导的凋亡以及AKT和ERK通路之间存在较强的代偿作用等机制抵抗失巢凋亡。6.在肝癌细胞还没有获得抵抗失巢凋亡能力时将其置于乏氧条件下,则失去附着和正常附着生长的细胞间活性差别不大,一定程度上都能够耐受低氧刺激,但是,如果将已经获得抵抗失巢凋亡能力的转移性肝癌细胞和贴壁生长的肝癌细胞同时放入低氧环境中,则转移性肝癌细胞抵抗低氧的能力明显高于正常贴壁生长的细胞。说明抵抗失巢凋亡能力的获得有助于转移性肝癌细胞耐受低氧环境。7.表达谱芯片中差异表达基因与microRNA芯片中差异microRNA调控基因吻合良好,其中表达谱芯片结果中转移性肝癌细胞表达明显增高的NDRG1、CA9、BNIP3相对应的hsa-miR-620、hsa-miR-516a-3p/516b^*、hsa-miR-342、hsa-miR-558等在转移性肝癌细胞中显著下调。8.利用反义寡核苷酸直接封闭聚集成团的转移性肝癌细胞中的基因比较困难,需要将反义寡核苷酸事先转染入贴壁生长细胞6 h后再分别接种为贴壁生长组和悬浮生长组,以达到最佳的转染效率和转染稳定性。9.反义封闭ANGPTL4后,转移性肝癌细胞的活性受抑制程度明显高于正常贴壁生长的肝癌细胞,而且其死亡率增高也比正常生长肝癌细胞明显,说明ANGPTL4在转移性肝癌细胞生长过程中发挥重要作用。创新点及意义:1.本研究首次报导转移性肝癌细胞通过“肿瘤反击”来逃逸机体的免疫监视功能,并且其侵袭力明显增强。2.本研究首次报导转移性肝癌细胞的AKT、ERK通路之间存在很强的代偿作用,当抑制AKT通路后磷酸化ERK蛋白的水平明显提高。这种代偿作用可使转移性肝癌细胞抵抗相应抗肿瘤药物的攻击,提示我们可以联合应用这两条通路抑制剂来治疗转移性肝癌。3.本研究率先提出获得抵抗失巢凋亡能力的转移性肝癌细胞抵抗低氧的能力明显高于贴壁生长的细胞。4.本研究将表达谱芯片中差异表达基因与microRNA芯片中差异microRNA调控基因相比较,筛选可能参与调控转移性肝癌细胞转移能力的关键分子,临床应用价值更高。5.本研究首次探讨了反义转染聚集成团细胞的方法,为反义寡核苷酸转染以及其他小分子物质进入聚集成团细胞提供了有价值的参考。