棉铃虫是世界范围内的重要农业害虫,因其繁殖力高、适应性强、寄主范围广等特点,对其持续防治愈发困难。利用代谢酶系对植物次生物质等异源有毒物质进行解毒、排毒是昆虫进化发展出适应生存环境的一个重要策略,通过干扰、敲除关键代谢酶基因,阻断昆虫对异源物质的代谢过程,能够达到控制害虫的目的。本学位论文采用转录组测序结合RNAi干扰技术,发现CYP4L11,CYP6AB9和CCE001a基因与棉铃虫代谢棉酚相关;结合基因组数据及转录组测序对棉铃虫ABC转运蛋白家族进行鉴定并解析了其在不同发育历期、不同组织中以及不同寄主处理下的表达模式;采用CRISPR/Cas9技术对ABCB6进行基因敲除后发现,敲除品系对棉酚的敏感性发生了变化;最后,以棉铃虫Bt受体Cadherin为靶基因结合双sgRNA策略,实现了CRISPR/Cas9系统介导的棉铃虫基因组片段删除,并以棉铃虫另一个Bt受体ABCC2基因为靶基因验证了双sgRNA介导下的片段删除在棉铃虫体内具有普遍适用性。本论文主要研究结果如下:1 CYP6AB9、CYP4L11和CCE001a参与棉铃虫代谢棉酚采用RNA-seq技术对棉铃虫取食棉花、大豆、辣椒、玉米及人工饲料后代谢酶表达模式进行了解析。差异基因聚类分析显示取食玉米和大豆的棉铃虫基因表达模式相似,而取食棉花的棉铃虫基因表达模式不同于玉米、大豆和辣椒。以q-value<0.005&|log2FoldChange>1.5|为阈值筛选出取食棉花后有显著差异的代谢酶基因,其中P450筛选出19个,UGT筛选出15个,GST筛选出3个,CarE筛选出6个。将同时在棉花vs辣椒、棉花vs玉米和棉花vs大豆处理中q-value<0.001且log2(fold-change)>1.5的代谢酶基因进行进一步筛选,共筛选出6个基因。采用qPCR技术对筛选出的6个候选基因(CYP6AB9、CYP18B3、CYP4L11、CCE001a、CCE001d、GSTD5)进行了验证,结果与转录组数据相符。随后采用qPCR技术对棉铃虫取食棉酚后6个候选基因的表达变化进行了研究,结果显示除了CCE001d基因外,其余5个基因表达量显著上调(P<0.05)。其中CYP6AB9和CYP4L11基因表达量上调倍数超过15倍。利用RNAi技术对6个候选基因与棉酚代谢的关系进行了研究,结果表明,注射6个候选基因的dsRNA均能有效干扰标靶基因的表达水平,干扰效率在50%左右。对干扰后的棉铃虫饲喂含有棉酚的饲料,2天后试虫体重变化出现差异。其中注射dsCYP4L11,dsCYP6AB9和dsCCE001a的试虫体重增长受到抑制,而注射其他dsRNA处理的试虫体重变化与对照组无明显差异。另外,将注射6个靶标dsRNA的试虫饲喂正常料,2天后体重变化与对照组无显著差异,排除了靶标基因自身参与调节棉铃虫幼虫生长发育的可能。由此可见,基因CYP6AB9、CYP4L11和CCE001a与棉铃虫代谢棉酚有关。2棉铃虫ABC转运蛋白ABCB6参与棉酚代谢结合基因组序列及转录组数据,对棉铃虫ABC转运蛋白家族进行了鉴定。共鉴定出54个ABC转运蛋白基因,分属于8个亚家族(A-H),其数量与其他鳞翅目昆虫ABC转运蛋白数量相当。依据结构域不同,ABC转运蛋白可分为全转运蛋白、半转运蛋白以及四分之一蛋白,其对应数量分别为21、30和3。ABCD/E/F/H亚族含有基因数目较少,分别为2、1、3和3个,ABCG为棉铃虫体内最大的亚族,含有17个基因。ABC转运蛋白中含有特征氨基酸片段LSGGQ的有49个基因,占总数的90%,表明ABC转运蛋白具有很高的结构保守性。采用RNA-seq技术对棉铃虫ABC转运蛋白的时空表达谱进行了解析。不同发育阶段的转录组测序结果显示54个棉铃虫ABC转运蛋白在不同的发育阶段表达量变化呈现出多样性,差异聚类分析结果显示,幼虫的五个龄期聚类在一支,卵与蛹和雌蛾聚类到一支,雄蛾子比较特殊,单独聚为一支。不同组织间的表达模式同样具有多样性,在头部中有多个ABC基因高表达,包括A/C/H亚族成员。相比于中肠和后肠,ABC基因在前肠中表达较低。随后对棉铃虫ABC转运蛋白应对不同寄主植物的表达模式进行解析。聚类分析结果显示玉米和辣椒聚在一支,然后与棉花、大豆聚类。棉花作为棉铃虫最适宜寄主之一,其基因表达模式整体呈现低表达状态,仅B亚族(HaOG200336)和C亚族(HaOG200302)中个别基因上调;取食辣椒后,B/C/G亚族中部分基因上调。采用qPCR技术对棉酚处理后的HaOG200336(即ABCB6)基因表达水平进行研究,结果显示,饲喂0.1%浓度的棉酚饲料后,ABCB6基因的表达量出现下调,随着棉酚含量的升高,ABCB6基因的表达量出现上调的趋势。饲喂0.2%和0.4%棉酚饲料均可引起ABCB6基因表达量的显著上调。为了深入分析ABCB6基因,采用转录组数据结合RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术的方式克隆获得了棉铃虫ABCB6基因的全长序列,ORF长2541bp,编码847个氨基酸。跨膜蛋白在线预测软件结果显示ABCB6含有11个疏水肽段,与人ABCB6、ABCB10比较后发现,棉铃虫ABCB6疏水肽段与人ABCB6疏水肽段在数量及特点上相似,在N端前220氨基酸内具有五个独特的疏水肽段。与其他物种ABCB6基因进行同源比对,结果显示相似性较高。另外亚细胞定位结果显示ABCB6基因与溶酶体共定位。采用CRISPR/Cas9技术对棉铃虫ABCB6基因进行敲除,研究其功能。设计了两个不同的sgRNA,检测结果显示sgRNA1介导的编辑效率为56.2%而sgRNA2介导的编辑效率仅为16.7%,该结果说明sgRNA的选择直接影响编辑效率同时也说明CRISPR/Cas9技术在棉铃虫上适用。选取其中一个删除7bp的突变类型进行纯化,经过两代的筛选得到了一个纯合的ABCB6基因敲除品系,命名为96S-B6-/-。利用该敲除品系对ABCB6基因参与棉酚代谢的功能进行研究。生物测定结果显示,低浓度时敲除品系体重增长略低于对照品系,但无显著性差异,棉酚含量达到0.4%时,敲除品系的体重增长被严重抑制,与对照品系表现出显著差异。综上所述,棉铃虫ABCB6基因参与了棉铃虫对棉酚的代谢过程。3 CRISPR/Cas9系统介导的棉铃虫基因组片段删除对CRISPR/Cas9系统在棉铃虫上的应用进行扩展,采用双sgRNA策略对棉铃虫Bt受体Cadherin基因进行长片段删除。通过设计两个不同靶标位置的sgRNA,调整sgRNAs与Cas9蛋白的浓度比,得到了编辑效率为34%的片段删除。选取其中338bp片段删除的突变类型进行纯化,最终获得了纯合突变品系,命名为96-cad,证明了CRISPR/Cas9介导的片段删除可以进行遗传。采用qPCR技术对编辑品系96-cad中Cad的表达量进行检测,结果发现96-cad中检测不到Cad的表达而对照96S品系中Cad基因的表达正常。已有的研究表明,Cad的突变与棉铃虫对Cry1Ac产生高水平抗性遗传连锁。用生物测定的方法检测编辑后的品系96-cad对Cry1Ac敏感性的变化。结果显示相比于敏感品系,编辑品系96-cad对Cry1Ac的敏感性显著降低,抗性水平达到794倍。另外选取了棉铃虫ABCC2基因作为靶标基因验证CRISPR/Cas9系统介导的基因组片段删除在棉铃虫体内具有普遍适用性,结果显示26%的个体出现了片段删除。该研究内容发现CRISPR/Cas9系统可介导棉铃虫基因组的片段删除,增加了棉铃虫基因功能研究的实验手段。综合分析,本学位论文研究成果不仅加深了昆虫解毒代谢酶对植物次生物质代谢机理的认知,丰富了ABC转运蛋白家族的信息,为防治棉铃虫提供新的靶标基因,还对CRISPR/Cas9系统在棉铃虫上的应用进行了探索并且验证了CRISPR/Cas9系统介导的基因组片段删除在棉铃虫上具有可行性。