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【目的】1.探讨与非恶性血液病及正常人相比,在急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞中长链非编码RNA-LLEST的差异性表达。并分析其与临床预后及复发的相关性。2.研究过表达长链非编码RNA-LLEST对人白血病细胞株(K562细胞)生物学功能的影响,并对其可能的作用机制进行探索。3.研究长链非编码RNA-LLEST在动物体内的作用。【方法】收集近年来经我院MICM分型确诊的AML、骨髓增生异常综合征(MDS)及再生障碍性贫血(AA)患者骨髓单个核细胞标本共数百例,对照组取正常健康人骨髓单个核细胞及一些良性血液病患者(如贫血,血小板减少)。采用基因芯片技术分析MDS和AA患者中LLEST表达量的差异性,同时利用实时定量PCR再对AML患者中LLEST含量进行检测。选取五例AML-M2病人,对其初治时及诱导化疗达缓解后骨髓中单个核细胞LLEST的表达量进行分析。再对AML-M2患者中LLEST的表达量与疾病的严重程度、原始细胞比例、AML-ETO融合基因定量值进行相关性的分析。收集19例初治的AML-M2患者的临床与实验室检查资料,在一个疗程化疗结束后,对其LLEST含量的中位值进行检测,随访患者的疗效、复发及长期生存情况,说明其表达量对患者复发及预后的影响。利用分子生物学的相关技术,使人白血病K562细胞过表达LLEST后对其生物学行为进行一系列的研究,并对其可能的作用机制进行研究探索。最后用裸鼠建立体内模型对LLEST在体内的功能进研究。【结果】1. LLEST表达的差异性及其临床意义基因芯片结果显示,与正常组织相比,LLEST在慢性再生障碍性贫血(CAA)病例骨髓CD34+细胞中呈高表达态势,而在相对恶性的MDS中呈低表达态势,由良性血液病向恶性血液病转变过程中LLEST逐渐降低,直至AML的CD34+细胞中不表达。通过实时定量PCR在AML(M1,M2,M3,M5)骨髓单个核细胞中也证实了LLEST表达量非常低。对于所选取的5例初治AML-M2患者来说,化疗前LLEST的表达量非常低,经过诱导化疗达缓解后LLEST都出现了不同程度的表达,说明LLEST的表达量同疾病的状态具有相关性。扩大样本进一步研究发现,LLEST的表达同肿瘤负荷成反比,也就是说,肿瘤负荷越高,原始细胞比例就越高,AML-ETO拷贝数就越高,病情越重,而LLEST表达量反而越低,结果具有统计学差异(p<0.05)。对部分患者跟踪随访显示,一个疗程化疗结束后LLEST表达水平的高低与疾病的复发具有相关性,LLEST表达量越高,越不容易复发,由样本量过少,还需进一步补充。2.过表达LLEST对体外白血病细胞株生物学行为的影响及作用机制的探索通过分子克隆及细胞培养技术,利用脂质体携带含有LLEST基因的质粒转染低表达LLEST的人白血病K562细胞株使其过表达后,对其生物学特性进行检测后发现,LLEST能抑制肿瘤细胞的生长,使细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞的凋亡和分化。Western Blot结果显示,具有剪切活性的caspase9蛋白含量的增加,和BCL-2含量的减少是介导细胞出现凋亡的主要机制。此外,还通过定量PCR研究了ATP6v1c1基因的表达,其含量的降低参与了对肿瘤细胞生存优势的负性调节。3.体内实验结果我们通过裸鼠的皮下成瘤实验进一步证实,高表达LLEST的白血病细胞株成瘤率明显降低,其瘤体的体积明显缩小。【结论】生物信息学分析提示,LLEST是一个长链非编码RNA,LLEST在恶性血液病中呈现出低表达态势。LLEST表达量越高的AML-M2患者其病情越轻、原始细胞比例越少、复发率低、预后好。体外细胞株实验证实,过表达LLEST对白血病细胞株的恶性生物学行为具有负性调控作用,它能抑制肿瘤细胞的生长,使细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞的凋亡和分化,在这一过程中,凋亡通路上的蛋白(如caspase9、BCL-2)及其它基因(如ATP6v1c1)出现了异常表达,共同参与调节。裸鼠皮下成瘤实验结果也证明了其对肿瘤细胞具有抑制作用。