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目的:(1)通过检测NRSN2在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞中的表达差异,研究NRSN2与骨肉瘤发生之间的相关性。(2)通过沉默/过表达NRSN2骨肉瘤细胞系的体内体外实验,探讨NRSN2对骨肉瘤细胞增殖、分化的作用。(3)探讨NRSN2在骨肉瘤细胞增殖、分化中的分子机制研究,确定NRSN2调控作用是否通过P13K/AKT/m TOR及Wnt/β-catenin信号通路。方法:(1)收集18例骨肉瘤和旁骨肉瘤组织标本,采用实时定量PCR及免疫组织化学法检测标本中NRSN2的mRNA及蛋白表达水平,分析NRSN2在骨肉瘤和旁骨肉瘤组织标本中的表达差异。(2)采用实时定量PCR及Western blot检测体外培养的U20S、Saos2、MG63骨肉瘤细胞系中NRSN2的m RNA和蛋白表达水平,分析NRSN2在骨肉瘤细胞系中的表达差异。(3)选择U20S、Saos2骨肉瘤细胞系(NRSN2相对高表达),构建沉默NRSN2的U20S、Saos2骨肉瘤细胞系,Western blot验证沉默效果;体外培养沉默NRSN2的骨肉瘤细胞系,采用CCK8法检测骨肉瘤细胞增殖、分化能力,通过软琼脂细胞克隆形成实验,测量克隆细胞数,沉默NRSN2的U2OS骨肉瘤细胞系接种裸鼠皮下,进行异种皮下肿瘤形成实验,测量瘤体重量,进一步分析沉默NRSN2在体内体外对骨肉瘤细胞增殖、分化的作用。(4)选择MG63骨肉瘤细胞系(NRSN2相对低表达),构建过表达NRSN2的MG63骨肉瘤细胞系,Western blot验证NRSN2过表达效果;体外培养过表达NRSN2的骨肉瘤细胞系,利用CCK8法检测骨肉瘤细胞增殖、分化能力,通过软琼脂细胞克隆形成实验,测量克隆细胞数,过表达NRSN2的骨肉瘤细胞系接种裸鼠皮下,进行异种皮下肿瘤形成实验,测量瘤体重量,分析过表达NRSN2在体内体外对骨肉瘤细胞增殖、分化的作用。(5)沉默NRSN2的U20S、Saos2骨肉瘤细胞系中,采用Wesrtern blot检测PI3K/AKT/m TOR及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、GSK3β、p-GSK3β、nu-β-catenin的蛋白表达水平,进一步采用实时定量PCR分别检测Wnt/β-catenin信号通路目标蛋白CCND1和c-myc的mRNA表达水平,分析沉默NRSN2对PI3K/AKT/m TOR及Wnt/β-catenin信号通路的调控。(6)过表达NRSN2的MG63骨肉瘤细胞系中,采用Wesrtern blot检测Akt、p-Akt、mTOR、p-m TOR、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin的蛋白表达水平,采用实时定量PCR检测Wnt/β-catenin信号通路目标蛋白CCND1和c-myc的m RNA表达水平,加入β-catenin抑制剂IWR-1-endo后采用CCK8法检测骨肉瘤细胞增殖、分化能力,分析过表达NRSN2对PI3K/AKT/mTOR及Wnt/β-catenin信号通路的调控。结果:(1)18例骨肉瘤组织标本中NRSN2的mRNA及蛋白表达水平均高于旁骨肉瘤组织标本,差异有统计学意义(P<0.01),提示:NRSN2与骨肉瘤相关。(2)U20S、Saos2、MG63骨肉瘤细胞系中NRSN2的mRNA和蛋白表达水平均高于hFOB1.19组,NRSN2与骨肉瘤细胞增殖、分化相关,差异有统计学意义(均P<0.01)。U20S和Saos2骨肉瘤细胞系相对高于MG63骨肉瘤细胞系,差异有统计学意义(P<0.05),U20S和Saos2骨肉瘤细胞系间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)沉默NRSN2明显抑制骨肉瘤细胞系U2OS、Saos2的增殖、分化能力(P<0.01),重新上调NRSN2生物学作用后重新提高U2OS、Saos2骨肉瘤细胞系增殖、分化能力(P<0.01),沉默NRSN2组克隆细胞数少于对照组(均P<0.01),沉默NRSN2组裸鼠皮下形成的瘤体重量小于对照组(P<0.01),未转染和重新上调NRSN2组作为对照组。(4)过表达NRSN2使MG63骨肉瘤细胞系增殖、分化能力增强(P<0.01),重新下调NRSN2生物学作用后MG63骨肉瘤细胞系增殖、分化能力下降(P<0.01),过表达NRSN2组克隆细胞数多于对照组(均P<0.01),过表达NRSN2组裸鼠皮下形成的瘤体重量大于对照组(P<0.01),空质粒和重新下调NRSN2组作为对照组。(5)沉默NRSN2的U2OS骨肉瘤细胞系中p-Akt、p-m TOR、p-GSK3β、nu-β-catenin的蛋白表达水平,CCND1及c-myc的mRNA表达水平均低于对照组(P<0.01),未转染组和重新上调NRSN2组作为对照组。(6)过表达NRSN2的MG63骨肉瘤细胞系中p-Akt、p-mTOR、p-GSK3β、nu-β-catenin的蛋白表达水平,CCND1及c-myc的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.01),加入β-catenin信号通路抑制剂IWR-1-endo后,MG63骨肉瘤细胞系增殖、分化能力比对照组明显受到抑制(P<0.01),空质粒组作为对照组。结论:(1)通过检测骨肉瘤组织及U20S、Saos2、MG63骨肉瘤细胞系中NRSN2的mRNA和蛋白表达水平,确定NRSN2与骨肉瘤之间的相关性。(2)通过沉默/过表达NRSN2骨肉瘤细胞系的体内体外实验研究,进一步证实NRSN2对骨肉瘤细胞增殖、分化有促进作用。(3)通过NRSN2的分子机制研究,阐明NRSN2调控PI3k/AKT/mTOR及Wnt/β-catenin信号通路促进骨肉瘤细胞增值、分化。