神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是来源于中枢神经系统的多潜能干细胞,在神经发育及损伤的修复中发挥重要作用,但其相关研究的关键在于干细胞的获取及有效扩增方法的建立。神经干细胞的扩增包括普通培养条件下的扩增以及在特定条件下于三维支架材料上的扩增。文献报道神经干细胞在三维支架材料上的扩增、形态及离子通道功能表达均不同于普通二维培养条件下的行为特征,且更接近于体内条件下的功能特点。因此,本课题研究了海马干细胞的有效提取方法及其与三维微结构PLLA的复合情况。目的比较2种培养基下海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的生长特性,实现海马神经干细胞(NSCs)扩增的优化及其与聚乳酸(PLLA)三维微小凹图式的复合,初步筛选有利用于神经干细胞复合和干细胞特性维持的三维微结构构型。方法分离大鼠胚胎海马细胞并采用Neurobasal为基础的培养基、DMEM?F12为基础的培养基进行扩增。以四甲基氮唑蓝(MTT)比色法及神经球数目统计法评价2种培养基下细胞增殖行为。采用紫外光光刻、硅蚀刻及软光刻技术制备PLLA三维微小凹图式并实现海马NSCs与微小凹图式的复合。采用光学显微镜检测细胞在微小凹图式上的生长行为,及免疫荧光法鉴定其在不同三维结构下的分化情况。结果原代分离的海马细胞呈神经干细胞标志物nestin阳性并能向神经元系和胶质细胞系分化。在30 d的扩增时间内,海马神经干细胞在以Neurobasal为基础的培养基中缓慢扩增聚集成神经球,少见细胞贴壁及分化;在以DMEM?F12为基础的培养基中海马神经干细胞扩增迅速,但易贴壁和分化。培养第25天时后者神经球数量为前者的4.7倍。因此,序贯应用两种培养基可以实现海马干细胞的有效扩增。微加工制备的微小凹图式结构清晰、稳定,具有高纵横结构比(≥1)。扩增的海马神经干细胞能在三维微小凹图式上成功复合生长,微结构中微小凹直径以及通道的有无和宽度明显影响微结构中细胞生长的数量。随着微小凹直径的增大,微结构中生长的细胞数量相应增多;随着微小凹之间通道结构的引入以及通道宽度从20μm增加至40μm,细胞生长的数量也相应增多。无通道微结构中的细胞基本无神经突起的伸出;有通道微结构中的细胞伸出大量的神经突起,且突起沿微通道方向延伸。结论以DMEM?F12为基础的培养基有利于大鼠海马NSCs的扩增,以Neurobasal为基础的培养基利于海马NSCs的纯化。序贯应用2种培养基可有效扩增海马神经干细胞并实现其与三维微小凹图式的复合。没有通道的微结构利于干细胞特性的保持,有通道的微结构利于干细胞的分化且神经突起沿通道方向延伸。