单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)是一种常见的人类病原体包括单纯疱疹Ⅰ型(HSV-1)和单纯疱疹Ⅱ型(HSV-2)两种类型,二者基因同源性高达70%。人体在初次感染HSV-2后,病毒会终身潜伏在人体的三叉神经或骶骨神经中,潜伏期间无任何症状,只有潜伏相关转录本(Latency-assistant Transcript,LAT)可被大量检测。HSV-2潜伏复发的特性是生殖器疱疹易复发,难根治的主要原因。CTCF(CCCTC-Binding Factor),是广泛存在于真核生物的多功能转录因子,是一种在进化上高度保守的多锌指、DNA蛋白,可结合在不同DNA靶序列上发挥调控功能。在HSV-1病毒LAT基因周围存在多个CTCF结合位点,HSV-1的潜伏再复发过程通常都伴随有CTCF的结合与解离,CTCF结合在HSV-1上能够抑制病毒启动子转录,使病毒难以复制长期处于潜伏状态。HSV-2与HSV-1有很高的同源性,且CTCF在HSV-2潜伏期间也会在LAT区域大量聚集和脱落,但CTCF调控HSV-2的结合位点和机制尚不明确。本论文旨在研究CTCF在HSV-2潜伏再激活过程的机制,具体包括:1.鉴定在HSV-2上可能与CTCF转录因子的结合的位点序列。2.验证其中一条序列的调控作用。研究方法包括:1.利用非洲绿猴肾细胞细胞复苏扩增HSV-2VR734病毒株,调整病毒浓度后感染四周大的BABL/c小鼠,观察BABL/c小鼠感染状态。2.BABL/c小鼠从急性感染进入潜伏感染状态28天后,提取BABL/c小鼠三叉神经节和骶骨神经节,利用免疫组化实验检测BABL/c小鼠组织内HSV-2病毒和CTCF蛋白含量的变化,并利用RT-PCR方法检测组织内LAT基因的相对表达量。3.随后提取BABL/c小鼠组织进行染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay,CHIP)实验,得到抗原抗体杂交物,并利用二代高通量测序技术对富集目的蛋白的DNA片段进行测序,得到生物信息学分析测序结果,并与HSV-2全基因组进行比对,确认CTCF结合位点序列,并利用GO分析和Pathway分析与CTCF蛋白相关的BABL/c小鼠生物活性信号通路。4.以所有序列中峰值最高的序列作为模板,利用PCR扩增后,插入到p GL-3-promoter载体质粒上。重组质粒转染到293T细胞中,检测裂解细胞荧光强度,明确CTCF结合位点序列对启动子的调控作用。实验结果:1.BABL/c小鼠在病毒感染后,出现明显的病变期与潜伏期,感染后的BABL/c小鼠三叉神经和骶骨神经内LAT基因的相对表达量相对于未感染BABL/c小鼠具有显著差异(p值<0.05)。对BABL/c小鼠组织的免疫组化检测,实验组中染色明显,HSV-2病毒和CTCF含量显著增加,表明HSV-2成功感染BABL/c小鼠,并进入潜伏状态。2.利用CHIP-seq对比分析,发现在HSV-2转录启动子附近有大量CTCF结合片段序列,通过峰值分析得到6组CTCF结合位点序列,并分析得到CTCF蛋白与BABL/c小鼠的NF-kappa B和趋化因子通路具有较大的相关性。3.p GL-3-promoter的荧光活性检测表明,重组质粒的细胞组荧光强度相比对照组显著降低,说明插入序列对启动子转录具有显著的减弱作用。综上所述,本研究通过建立HSV-2潜伏感染BABL/c小鼠模型,验证了利用生物信息学分析的CTCF蛋白在HSV-2中可能的结合位点,并且针对该结合位点进行了表达调控功能的研究,发现其具有阻碍启动子功能。在一定程度上补充了CTCF在HSV-2病毒中的潜伏复发机制的研究空缺,并为临床治疗和诊断药物研究提供了参考。